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1、螞蝗抗凝血酶活性物質提取工藝改進論文【摘要】目的通過正交實驗研究中藥水蛭中抗凝血酶活性物質提取的最佳工藝。方法采用正交實驗設計法，以提取溫度，生理鹽水用量，提取次數(shù)和提取時間為考察因素，每個因素設計3個水平進行實驗。以測得的水蛭素含量和蛋白質含量計算出水蛭素的比活力做為評價指標進行正交實驗。結果最佳提取工藝為：15倍溶劑量，溫度為70℃，提取時間為30min，提取次數(shù)為兩次。結論該方法可為中藥水蛭中抗凝血酶活性物質的提取提供依據(jù)?！娟P鍵詞】水蛭素;蛋白質;正交實驗;提取工藝水蛭是傳統(tǒng)的破血逐瘀藥.freelan，螞蝗型高速冷凍離心機
2、(長沙平凡儀器儀表有限公司)，HHZ-4型恒溫水浴鍋(鄭州長城科工貿有限公司)，微量移液器(DRAGON-MED)，Spe-54型雙光束紫外分光光度計(上海棱光技術有限公司)。1.2材料水蛭藥材購于河北安國中藥材市場(經(jīng)佳木斯大學藥學院生藥學教研室劉娟教授鑒定為螞蝗A，F(xiàn)8630-200mg，凝固物含量為75%);牛血清白蛋白(BSA，SIGMA，A730-5g，98%);Tris堿、鹽酸、生理鹽水、硫酸銅、酒石酸鉀鈉均為國產(chǎn)分析純。2方法與結果2.1溶液的制備根據(jù)相關文獻資料和預試驗3，取水蛭干燥全體用銼刀銼成細粉，稱取水蛭細粉9
3、份，每份2.0g。以生理鹽水為提取溶劑，以提取次數(shù)、提取溫度(℃)、提取時間(min)和提取溶劑倍量為考察因素，每個因素選擇3個水平，以測得的水蛭素的含量和蛋白質的含量計算得出的水蛭素比活力作為考察指標。選用L9(34)正交表進行實驗，對中藥水蛭中水蛭素的提取工藝進行研究，并對結果進行方差分析和顯著性檢驗。各因素及水平見表1，正交實驗設計方案及結果見表2。2.2水蛭素活力的測定精密量取提取液上清液100μl，置試管(20mm×10mm)中，加入含0.5%牛纖維蛋白原(以凝固物計)的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液200μl，搖勻，置37
4、℃水浴中預溫2min。緩緩滴加20IU·ml-1的凝血酶溶液(每1min不超過5μl，也就是0.1IU的凝血酶)，邊滴加邊輕輕搖勻，至出現(xiàn)絲狀凝固，記錄消耗凝血酶溶液的體積。按下式計算抗凝血酶活性(U):U=20(IU·ml-1)×V(ml)×l)。其中，V為消耗凝血酶溶液的體積，g·ml-1)0，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6ml，用蒸餾水補足至2ml，分別加人4ml雙縮脲試劑在室溫下放置30min，置于540nm波長處比色，測得吸光度值分別為0，0.112，0.225，0.338，0.477，0.601，以吸光度(A)為
5、縱坐標，牛血清白蛋白含量(C)為橫坐標繪出標準曲線，以最小二乘法得其線性方程為A=46.8803×10-3C+2.5523×10-3，r=0.9998，表明在此濃度范圍內有良好的線性關系。2.3.2雙縮脲試劑的配制取硫酸銅試劑(CuSO4·5H2O)1.5g和6g酒石酸鉀鈉(NaKC4H4O6·4H2O)溶于500ml蒸餾水中，再加入300ml10%的NaOH溶液并不斷攪拌，用蒸餾水定容至1000ml容量瓶中，放冷待用。2.3.3雙縮脲比色法測水蛭提取液中蛋白質含量精密量取水蛭提取液2ml，分別加人4ml雙縮脲試劑后在室溫下放置30
6、min，置于540nm波長處比色，測定其吸光度值。代入線性方程，計算蛋白質含量，進而得出水蛭提取液中蛋白質的總含量。2.4水蛭素比活力的計算根據(jù)所測得的水蛭素活性與蛋白質含量就可以計算出水蛭素的比活力，計算公式為：水蛭素比活力(ATU·mg-1)=水蛭素總量(ATU)/蛋白質總含量(mg)。表1因素水平2.5實驗結果以水蛭素含量和蛋白質含量來計算水蛭素比活力為綜合評價指標，采用SPSS13.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行方差分析。由表2可知因素C的極差最小，也就是對本試驗的影響最小，所以以此項為誤差項進行方差分析。結果見表3。根據(jù)正交實驗結果、
7、直觀分析及方差分析結果可見各因素對水蛭素得率影響的順序為：ABDC。由表3可知，A和B兩項因素的P值小于0.05，對實驗結果影響顯著，因素D的P值大于0.05，說明因素D對實驗因素影響不顯著。因此因素A和B為主要因素，D和C因素為次要因素。因此，本實驗的最佳的提取工藝為：A3B3D2C2，即在70℃，15倍劑量的條件下提取兩次，每次30min為最佳的提取工藝。表2L9(34)正交實驗方案及結果3討論通過本實驗的研究表明，合理地利用正交實驗不僅省時、省力，還可以達到很好的實驗效果。使用SPSS統(tǒng)計軟件包對L9(34)正交實驗結果進行數(shù)
8、據(jù)處理，只要按正交表的設計格式輸人實驗數(shù)據(jù)，便可獲得所需的統(tǒng)計結果。其操作方便、直觀、快捷，結果準確。此法也可用來處理其他正交實驗的數(shù)據(jù)。表3方差分析結果以往的文獻報道多以提取物總氮提取率、水蛭素含量或抗凝血作用作為提取工藝篩選的考察
