白藜蘆醇體外及小鼠體內(nèi)抗白血病作用機制

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1、白藜蘆醇體外及小鼠體內(nèi)抗白血病作用機制【摘要】  目的:探討白藜蘆醇(resveratrol,Res)體內(nèi)外抗白血病作用的分子機制?! 》椒ǎ翰捎肏uT78、Jurkat和L12103種白血病細(xì)胞株,不同濃度Res作用不同時間后,應(yīng)用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖情況,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,蛋白印跡法檢測Bcl2和Bax蛋白表達(dá),免疫沉淀法檢測信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(signaltransducersandactivatorsoftranscription,STAT)3及其磷酸化活性(phosphoTyr705ST

2、AT3,pSTAT3)。BALB/c小鼠隨機分為模型組和12.5、25、50mg/(kg·d)Res組,皮下注射L1210細(xì)胞建立白血病模型。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,RTPCR)檢測各組白血病小鼠外周血T淋巴細(xì)胞白細(xì)胞介素6(interleukin6,IL6)基因表達(dá),流式細(xì)胞儀檢測IL6蛋白分泌,免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡法檢測肝臟活性pSTAT3蛋白表達(dá)?! 〗Y(jié)果:Res能抑制白血病細(xì)胞HuT78、Jurkat、L1210的生長增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時明顯下調(diào)Bcl2/Bax比值、降低

3、活性pSTAT3的蛋白表達(dá);Res還能夠劑量依賴地下調(diào)白血病小鼠外周血T淋巴細(xì)胞IL6mRNA表達(dá)及其胞內(nèi)分泌,同時降低小鼠肝組織中活性pSTAT3蛋白表達(dá)水平?! 〗Y(jié)論:Res體內(nèi)外均具有明顯的抗白血病效應(yīng),其作用機制可能與其對IL6及pSTAT3的影響有關(guān)。【關(guān)鍵詞】白藜蘆醇;細(xì)胞凋亡;白血病;白細(xì)胞介素6;STAT3轉(zhuǎn)錄因子;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)接頭蛋白類;小鼠;體外研究  Methods:Threekindsofleukemiacelllines,HuT78,JurkatandL1210cells,ent,methylthiazolyltetrazolium(MTT)colorim

4、etryetry;SO)成1g/L,濾過除菌,-20℃貯存。用時以RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度,使DMSO終濃度不高于0.1%,此時對細(xì)胞生長活性無影響。臺盼藍(lán)染色法活細(xì)胞計數(shù)≥95%,調(diào)整細(xì)胞濃度為5000個/ml,以6.25、12.5、25、50、100和200μmol/LRes分別培養(yǎng)HuT78、Jurkat和L1210細(xì)胞12、24和48h。加入5mg/ml甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT),終濃度0.2mg/ml,再培養(yǎng)4h,棄上清,加入DMSO溶解沉淀,570nm處測定吸光度(absorbance,A)值,計數(shù)細(xì)胞生長抑

5、制率及半數(shù)抑制濃度(inhibitingconcentration50%,IC50)?! ?.3AnnexinV法檢測細(xì)胞凋亡調(diào)細(xì)胞終濃度為1×105個/ml,用100μmol/LRes培養(yǎng)HuT78、Jurkat和L1210細(xì)胞12、24和48h,空白對照組加等體積RPMI1640培養(yǎng)基。FITC標(biāo)記的AnnexinV和碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色后,通過流式細(xì)胞儀(FACScan型,美國BD公司)定量檢測各組細(xì)胞凋亡情況?! ?.4蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白Bcl2、Bax的相對表達(dá)以IC50Res培養(yǎng)各組白血病細(xì)胞24h,蛋白印跡法分析Res對凋亡相關(guān)

6、蛋白Bcl2和Bax的影響。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectropheresis,SDSPAGE),半干法轉(zhuǎn)膜1.5h,加入相應(yīng)一抗(1︰200稀釋)及辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)標(biāo)記的二抗(1︰5000稀釋),增強化學(xué)發(fā)光(enhancedchemiluminescence,ECL)法檢測,最后進(jìn)行圖片掃描和分析,采用QuantityOne軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以βactin蛋白為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析?! ?.5免疫沉淀法檢測活性pSTAT3蛋白表達(dá)0.5%血

7、清饑餓12h,以25、50和100μmol/LRes培養(yǎng)HuT78、Jurkat和L1210細(xì)胞24h,并設(shè)空白對照組。提取細(xì)胞蛋白,以充分重懸的蛋白G瓊脂糖(proteinGagarose)進(jìn)行沉淀,BCA法測定蛋白濃度,分別取各組細(xì)胞50μg總蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳,pSTAT3稀釋倍數(shù)為1︰1000,以非磷酸化抗體作內(nèi)標(biāo)參考?! ?.6動物給藥及模型建立參見  2.6Res下調(diào)白血病小鼠活性pSTAT3

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