大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、cck受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響論文

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1、大鼠海馬神經(jīng)元中μ阿片受體、CCK受體的表達(dá)及慢性嗎啡作用對(duì)其表達(dá)的影響論文【摘要】目的:研究MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的分布和嗎啡對(duì)其受體的影響.方法：用激光共聚焦掃描技術(shù)，以神經(jīng)元特異性標(biāo)記抗體NF200對(duì)原代海馬神經(jīng)元進(jìn)行鑒定，采用特異性的MOR1，CCKAR，CCKBR的抗體觀察觀察它們?cè)诤ｑR神經(jīng)元上的表達(dá).選用雄性O(shè)R)，沈陽第一制藥廠生產(chǎn)，批號(hào)：遼寧藥準(zhǔn)字(1996)第002747號(hào).DMEM培養(yǎng)基、NeurobasalMedium，B27(美國(guó)Gibco

2、公司)；山羊抗CCKA，山羊抗CCKB抗體，兔抗MOR1多克隆抗體，F(xiàn)ITCdonkeyantimouseIgG，BiotindonkeyantirabbitIgG(美國(guó)SantaCruz公司)；TRITCrabbitantigoatIgG，F(xiàn)ITCrabbitantigoatIgG，F(xiàn)ITCgoatantirabbitIgG(北京中山生物公司)；CY5antirabbitIgG(Camical公司)；小鼠抗NF200單克隆抗體(NEOMARKERS公司)；兔抗膠質(zhì)纖維

3、酸性蛋白（GFAP）多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leica)；EpicsXL流式細(xì)胞儀(美國(guó)BeckmanCoulter).1.2方法1.2.1原代大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)取出生1d的大鼠在無菌條件下分離海馬組織，制備細(xì)胞懸液，用含B27Supplement的NBM進(jìn)行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng).1.2.2神經(jīng)元鑒定取培養(yǎng)6d的大鼠海馬神經(jīng)元，用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行鑒定，一抗分別為GFAP多克隆抗體和NF200單隆抗體，二抗分別為Biotindonkeyantirab

4、bitIgG＋CY5antidonkeyIgG和FITCdonkeyantimouseIgG，標(biāo)記后選擇不同視野細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦掃描40ｘ（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm）.1.2.3MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)將原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為NF200/MOR1，NF200/CCKAR，NF200/CCKBR3組，特異性抗體同上，用免疫熒光標(biāo)記和激光共聚焦掃描技術(shù)檢測(cè)受體的表達(dá).1.2.4MOR1，CCKAR，CCKBR在嗎啡處理大鼠海馬神經(jīng)元的表達(dá)

5、1.2.4.1給藥與分組60只健康雄性1～M9組（分別給予MOR1~9d），大鼠參照文獻(xiàn)［5］以劑量遞增法背部皮下給予嗎啡，首日嗎啡20mg/kg，分2次皮下注射(8:00,18:00).以后每日增加20mg/kg，9d8:00末次注射嗎啡1h后取大鼠海馬.每組n=6.1.2.4.2大鼠海馬神經(jīng)元的分離及檢測(cè)9d08:00末次注射嗎啡1h，按照本實(shí)驗(yàn)室方法分離海馬［6］，制備細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活性大于95％.無血清DMEM調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106/mL，用流式細(xì)胞儀隨機(jī)測(cè)定單個(gè)細(xì)胞的熒光強(qiáng)度

6、值（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)530nm）.每份標(biāo)本10000個(gè)細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度值為測(cè)定值，用以反映受體蛋白表達(dá).統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示.用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.各組均數(shù)的比較采用Duntt檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，將CCKAR與CCKBR作為整組采用配對(duì)T檢驗(yàn)對(duì)兩組間進(jìn)行比較，P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果2.1體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的鑒定結(jié)果顯示：NF陽性細(xì)胞標(biāo)記綠色熒光，GFAP標(biāo)記藍(lán)色熒光，在整張蓋片，NF陽性細(xì)胞90％以上，同時(shí)有散在的GFAP陽性細(xì)胞(圖1)

7、.2.2MOR1,CCKAR及CCKBR在海馬神經(jīng)元的表達(dá)在海馬神經(jīng)元膜，軸突和樹突上均有發(fā)藍(lán)色熒光的MOR1陽性表達(dá)產(chǎn)物（圖2A，D）；綠色熒光標(biāo)記物與紅色熒光標(biāo)記物重疊之后呈橙黃色熒光，CCKA,CCKB受體呈橙黃色標(biāo)記,在海馬神經(jīng)元膜表面廣泛分布（圖2B，C，E，F(xiàn)）.2.3嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元MOR1,CCKAR,CCKBR表達(dá)的影響采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)給予嗎啡后MOR1，CCKAR，CCKBR在海馬神經(jīng)元上的表達(dá).給予嗎啡2d時(shí)MOR1上調(diào)(P0.05)，5d時(shí)MO

8、R1開始出現(xiàn)下調(diào)，蛋白表達(dá)量顯著下降(P0.01)，并呈時(shí)間依賴性.給藥2d，CCKB受體的熒光強(qiáng)度值較對(duì)照組相比顯著升高(P0.05).給藥5d，CCKA受體的熒光強(qiáng)度值較對(duì)照組顯著升高(P0.01，表1).同一時(shí)間點(diǎn)CCKB受體的熒光值高于CCKA受體(P0.01，表1).表1嗎啡對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元MOR1,CCKB和CCKA受體表達(dá)的影響(略)3討論阿片類物質(zhì)長(zhǎng)期作用會(huì)引起細(xì)胞的一些適應(yīng)性改變，如阿片受體下調(diào)、內(nèi)吞以及環(huán)磷酸腺苷(cA