脆弱類桿菌熒光定量pcr法檢測(cè)

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1、脆弱類桿菌熒光定量PCR法檢測(cè)【關(guān)鍵詞】脆弱類桿菌；熒光定量PCR；SYBR,Green,I　　　摘要：目的探討熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)脆弱類桿菌。方法用特異性引物和熒光染料實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增并檢測(cè)產(chǎn)物。結(jié)果脆弱類桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25285)和4株分離株均有特異擴(kuò)增曲線，靈敏度達(dá)102個(gè)菌；而大腸埃希菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌無特異擴(kuò)增曲線。結(jié)論熒光染料實(shí)時(shí)PCR技術(shù)可特異并定量檢測(cè)脆弱類桿菌　　關(guān)鍵詞：脆弱類桿菌；熒光定量PCR；SYBRGreenI　　Detectionbacteriafr

2、agilebySYBRGreenreal-timePCR　　Abstract：ObjectiveToidentifythebacteriafragiles(B.fragiles)by16StargetrRNArealtimePCR.MethodsApairofspecificprimersePCR.ResultsTheB.fragilisATCC25285and4separativestrainsofB.fragilisappearedinthespecialamplificationprodu

3、ctcurve,ophilusdidnot.TheflourescentqantificativePCRcandetect102bacteria.Conclusion16SrRNAtargetedprimerandfluorescentquantifiverealtimePCRcanbeapplicablefortheidentificationandquantificationofB.fragilis.　　Keyp5700,美國(guó)Perkin-Elmer公司），離心機(jī)；細(xì)菌基因組提取試劑盒、Ex

4、TaqDNA聚合酶、10×緩沖液、SYBRPremixExTaqTM（perfectReal-time）熒光染料〔TakaRa寶生物工程（大連）有限公司〕?！　?2方法　　121引物設(shè)計(jì)在16SrRNA序列中第831-864位點(diǎn)和982-1007位點(diǎn)，通過分析軟件Blast(ncbinlmnihgov)同GenBank中大腸埃希菌等基因序列相比較，參照　　2結(jié)果　　21特異性PCR結(jié)果顯示，5株脆弱類桿菌均有特異擴(kuò)增曲線，而大腸埃希菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌無特異擴(kuò)增曲線?！　?2靈敏度（圖

5、1）圖1可見，熒光信號(hào)強(qiáng)度（Rn）維持在基線（0對(duì)應(yīng)的橫線）上，15個(gè)循環(huán)后，Rn開始上升。107，106，105的擴(kuò)增曲線在30個(gè)循環(huán)后到平臺(tái)期，104,103,102的擴(kuò)增曲線在38～40個(gè)循環(huán)時(shí)到平臺(tái)期。靈敏度達(dá)102個(gè)菌。.L.編輯?！　∽宰笙蛴业臄U(kuò)增曲線為：107,106,105,104,103,102,101μl　　圖1不同菌數(shù)的脆弱類桿菌標(biāo)準(zhǔn)株熒光定量PCR擴(kuò)增圖（略）　　23融解曲線（圖2）圖2可見，主峰為特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，從105～10細(xì)菌含量的主峰峰值逐個(gè)降低，但位置一致；主峰

6、前的小峰（79℃處）,可能是很少量的引物二聚體形成而致,并隨細(xì)菌含量（模板量）降低，主峰與小峰的峰值差減小?！　∽陨舷蛳碌姆寰€為105,104,103,102,101μl　　圖2擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線（略）　　3討論　　本文結(jié)果顯示，前引物序列831～864在脆弱類桿菌中完全互補(bǔ)，而與大腸埃希菌等互補(bǔ)序列不多；序列982～1007為脆弱類桿菌特有序列，其他細(xì)菌沒有與之相對(duì)應(yīng)的序列。熒光定量PCR表明，5株脆弱類桿菌有擴(kuò)增產(chǎn)物，采用相同引物用rPCR擴(kuò)增，在預(yù)計(jì)區(qū)域有擴(kuò)增條帶〔3〕，2種方法結(jié)果一致，

7、可與大腸埃希菌、乳酸桿菌、嗜熱鏈球相鑒別。本文受檢菌菌數(shù)可低至102，與其他