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《人oaz突變基因的克隆構建及重組蛋白表達論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、人OAZ突變基因的克隆構建及重組蛋白表達論文姜立馬文麗柯杰兵彭翼飛李晉徐兵鄭文嶺【摘要】目的構建人鳥氨酸脫羧酶抗酶（OAZ）突變基因，重組至原核表達載體中并表達出重組蛋白。方法采用基因定點突變技術在OAZ基因TCCTGATG(199～206)位置造成第202位堿基T堿基缺失，使核糖體的閱讀框+1移位，連續(xù)表達OAZ基因的ORF2部分。測序鑒定后，重組質粒轉化BL21菌，進行突變基因的蛋白表達。結果重組質粒經(jīng)測序后確認202位堿基T缺失，其余堿基序列無變化。重組的突變基因轉入BL21后在IPTG誘導下表達OAZ全
2、長蛋白，SDS-PAGE分析在相對分子質量45900左右出現(xiàn)新的蛋白條帶。結論成功構建人OAZ突變基因重組質粒.freele,OAZ）是在翻譯后水平的一種調控形式，它可以連接到ODC蛋白上，抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC，從而負性調控細胞內多聚胺含量。有研究表明，細胞內OAZ的過度表達在降低細胞內多胺水平的同時還能抑制細胞的生長。由此推測，OAZ在細胞的生長與分化過程中擔任著重要的角色［1~3］。OAZ蛋白的表達有一個非常有趣的移位翻譯現(xiàn)象，其表達受到精胺的一個稱之為frame-shiftin
3、g的核糖體移位的調控。多聚胺通過這種較罕見的調控機制誘導OAZ蛋白的生成，又反向抑制多聚胺在細胞內的濃度，使細胞在一個穩(wěn)定的多聚胺水平進行正常生長分化。OAZ轉錄本的編碼存在兩個不同的閱讀框，ORF1和ORF2。OAZ蛋白其實是一個由短的非保守的ORF1產物和高度保守的ORF2產物的組合。在OAZmRNA的閱讀框中，需要有一個+1的翻譯移碼過程。在ORF1的5′端終止密碼子處，通常序列為TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻譯框架達到TGA時，如果沒有精胺的存在，核糖體將接受TGA為終止密碼子，翻譯到
4、此終止。當精胺濃度一定時，核糖體的翻譯即可受到精胺的調控進行+1移碼，躍過終止密碼子TGA上的T，以GAT指導的天冬氨酸為后續(xù)，翻譯合成ORF2［4-5］。翻譯框架移碼受到細胞內多聚胺水平上升的正調控，表達出的OAZ蛋白又能調節(jié)ODC的酶活性，反向調節(jié)細胞內多聚胺的水平，從而影響到細胞的生長及分化。在生長旺盛的腫瘤組織中，普遍發(fā)現(xiàn)了ODC的高表達，因此，OAZ蛋白特有的調控ODC活性的功能，就使之成為腫瘤免疫治療的理想靶分子。但是，OAZ蛋白的表達受到精胺的誘導，缺乏精胺時，核糖體將不能進行+1的移位，翻譯完整
5、的全長OAZ蛋白。為此，本研究對OAZ基因進行了特定T堿基的缺失突變，成功構建至表達載體pET-32a中，測序確認后命名為pET-32a-OAZ-mutation，并在BL21菌中成功表達出OAZ全長蛋白，將對進一步研究該基因的功能以及以OAZ為靶點的腫瘤核酸疫苗的制備，具有重要意義。1材料和方法1.1試劑大腸桿菌DH5α、BL21和表達質粒pET-32a、pET-32a-OAZ-g/L)1μl、dNTP1μl、10×Buffer5μl、P1與P2引物(100mg/L)各2.5μl、PfuTurboDNA多聚酶
6、(2.5×106U/L)1μl、雙蒸餾水37μl加入PCR管;95℃預變性30s后，95℃30s、55℃1min、68℃6min，共18個循環(huán)。PCR產物置于冰上2min,加入1.5μlDpnⅠ內切酶(106U/L),37℃水浴2h，酶解模板DNA。1.2.2轉化大腸桿菌DH5α取感受態(tài)大腸桿菌50μl,加入上述DpnⅠ處理液10μl,輕輕混勻,冰浴30min→42℃熱休克45s→冰上2min，加入預熱的LB培養(yǎng)液0.5ml,置于37℃恒溫搖床中,200r/min振搖1h。1.2.3質粒擴增、提取及鑒定取200
7、μl菌液鋪到LB瓊脂培養(yǎng)板(含Amp)上,37℃培養(yǎng)12～16h。挑取單菌落,提取質粒。取質粒5μl,選取插入片段兩端的酶切位點XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切，酶切產物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠進行分析鑒定。含目的基因的質粒經(jīng)測序驗證目標堿基缺失后，命名為pET-32a-OAZ-mutation。1.2.4重組蛋白表達將含有pET-32a-OAZ-mutation的質粒轉化BL21菌，鋪板挑陽性菌落并酶切鑒定為陽性菌落后，接種至含5mlLB培養(yǎng)基中（含氨芐青霉素）振培過夜。次晨取100μl接種至新的5mlLB培養(yǎng)基中，3
8、7℃振培3～4h，至D值約為0.6時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)2h和4h后取菌液1ml，進行15%的SDS-PAGE電泳鑒定表達產物，以轉染空pET-32a質粒的BL21菌在同等條件下用IPTG誘導為陰性對照。2結果2.1pET-32a-OAZ-mutation測序圖PCR擴增后，DpnⅠ酶切產物并轉化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克
