人tshr膜外區(qū)cdna克隆及真核表達載體的構建論文

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1、人TSHR膜外區(qū)cDNA克隆及真核表達載體的構建論文武敏，施秉銀，伍麗萍，蘭玲，吳小燕，張進安，徐莉【摘要】目的通過生物技術獲得促甲狀腺激素受體膜外區(qū)表達載體，為TSHR膜外區(qū)的研究提供有力工具。方法從人甲狀腺組織中提取總RNA.freelmunethyroiddisease,AITD)發(fā)病過程中，促甲狀腺激素受體(thyrotropinreceptor,TSHR)是重要的自身抗原1，機體產生針對TSHR的自身抗體(thyrotropinreceptorantibody,TRAb)是其主要的發(fā)病機制。由于存在于甲狀腺細胞膜上的TSHR數(shù)量少，結構不穩(wěn)定，且難以純化，無法開

2、展TSHR的進一步研究。本文從人甲狀腺中提取RNA，通過逆轉錄獲得TSHR膜外區(qū)cDNA，構建真核表達載體，建立了有效的TSHR體外表達系統(tǒng)。1材料與方法1.1組織來源和實驗材料甲狀腺組織來源于已確診的Graves手術患者。DH5α感受態(tài)細菌購于北京鼎國生物技術有限公司，pMD18T克隆載體系日本TaKaRa公司產品，真核表達載體pcDNA3.1(+)系美國Invitrogen公司產品。RNAgentsTotalRNAIsolationSystem和AccesssRTPCRSystem為Promega公司產品，質粒提取及凝膠回收試劑盒為上海博亞生物公司產品。1.2P

3、CR引物的設計合成根據(jù)文獻報告人促甲狀腺激素受體cDNA序列資料2，由上海華諾生物科技有限公司設計并合成一對用于擴增hTSHR膜外區(qū)cDNA編碼區(qū)的寡核苷酸特異性引物：上游引物為5′ATTGGATCCAACATGGATATGAGGCCGGCGGACTTGCT3′，下游引物為5′GCCGAATCCCTACTTGTAGCCCATTATGTCTTCACAC3′。1.3總RNA的提取凍存的約100mg甲狀腺組織在盛有液氮的研缽中充分破碎，研磨成勻漿，按試劑盒說明逐步加入裂解液醋酸鈉、酚氯仿異丙醇，抽提組織中的總RNA，經乙醇漂洗后溶于無RNA酶滅菌去離子水。利用分光光

4、度器測定RNA的A260和A280值。1.4RTPCR及產物的純化RNA樣品預處理于75℃變性5min后速放冰上冷卻。RTPCR反應體系：AMV反轉錄酶(5u/μL)1μL，TfiDNA聚合酶(5u/μL)1μL，5×AMV/TfiBuffer10μL，上下游引物各3μL，最后混合RNA樣品加無RNA酶滅菌去離子水至50μL。混勻后置PCR儀上，逆轉錄反應條件設為：48℃逆轉錄60min，94℃預變性2min。PCR反應條件為：94℃變性30s，60℃退火60s，68℃延伸270s，45個循環(huán)后，68℃終延伸10min。對RTPCR產物經乙醇沉淀法進行純化濃縮。1.

5、5克隆質粒的構建根據(jù)TA克隆原理3將TSHR膜外區(qū)片段插入pMD18T克隆載體。將TSHR膜外區(qū)(thyrotropinreceptorectodominant,ETSHR)片段3μL(約75ngDNA)，pMD18T克隆載體1μL(約50ngDNA)，T4DNA連接酶0.5μL，10×連接酶緩沖液5μL，加去離子水至10μL，至PCR儀上16℃過夜。將連接產物轉入DH5α細菌，經IGTP/Xgal平皿(Amp+)篩選，挑選單個白色菌落，放入10mLLB培養(yǎng)液中，37℃振搖過夜。堿裂解法提取重組質粒，雙酶切法篩選攜帶目的片段的陽性克隆子并純化。1.6真核表達載體的構建

6、及鑒定將上一步提純的pMDETSHR重組質粒雙酶切后，定向插入pcDNA3.1(+)質粒。反應體系為pMDETSHR重組質粒5μL，10×KBuffer2μL，BamHⅠ和EcoRⅠ各1μL，加水至10μL。將酶切體系37℃過夜，65℃15min使滅活內切酶。經凝膠電泳后分離目的片段ETSHR，提純濃縮后加入真核表達載體pcDNA3.1(+)，再建立連接體系。連接產物導入感受態(tài)細胞，涂于瓊脂平板(Amp+)，挑選陽性克隆，酶切電泳分析，并送上海華諾生物科技公司鑒定。2結果2.1RTPCR產物的鑒定電泳后發(fā)現(xiàn)，在Mark標記約1500bp處存在單一條帶，特異性好，無其

7、他擴增產物出現(xiàn)(圖1)。2.2克隆質粒的電泳結果酶切電泳結果呈現(xiàn)分子量大小約為2690bp和1245bp的兩條清晰片段，證實該質粒中存在目的片段(圖2)。2.3真核表達載體的酶切鑒定結果酶切電泳后，出現(xiàn)分子量約5420bp和1245bp的兩條特異性DNA片段，其中的小片段與PCR產物一致，表明獲得正確克隆(圖2)。2.4測序結果克隆片段為1245bp的ETSHR編碼區(qū)，與已發(fā)表的序列完全一致2，證實有包括起始密碼子和kozak序列的完整ETSHR正確插入pcDNA3.1(+)質粒中。3討論Nagayama于1989年利用G蛋白