吡格列酮對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡及功能的影響論文

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1、吡格列酮對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖、凋亡及功能的影響論文邸春霞，陸慶明，郭文怡，王海昌，張榮慶，殷忠【摘要】目的：觀察不同濃度吡格列酮對(duì)大鼠骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）增殖、凋亡和功能的影響，并探討其可能的作用機(jī)制.方法：正常SD大鼠24只，隨機(jī)分為A組（對(duì)照組）和B,C,D組［吡格列酮組劑量依次為10.freelg/（kg·d）］，灌胃處理10d后斷頸處死，密度梯度離心法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)鑒定后證實(shí)為EPCs.每組細(xì)胞培養(yǎng)4d后消化、計(jì)數(shù)并用完全培養(yǎng)液培養(yǎng).24h后檢測(cè)NO生成量，3d后檢測(cè)凋亡情況，7d后檢測(cè)增殖能力.結(jié)果：與A組相比，B,C,D組EPCs

2、增殖能力明顯增高［B，C，D組A490nm分別為（0.423±0.004）,（0.680±0.008）,（0.443±0.005）vsA組A490nm（0.143±0.006）,P0.01］；凋亡程度降低［B，C，D組分別為(32.8±0.8)%，(30.9±2.3)%，(33.0±3.9)%vsA組(40.1±1.1)%,P0.01］；培養(yǎng)上清中NO濃度顯著提高［B，C，D組分別為（29.2±3.7），（41.0±7.7），（28.7±6.4）μmol/LvsA組（18.9±1.4）,P0.05］；與C組相比，B組和D組促進(jìn)EPCs增殖能力弱（P0.01

3、），培養(yǎng)上清中NO濃度相對(duì)低（P0.05）.結(jié)論：不同濃度吡格列酮均能提高EPCs數(shù)量和功能；20mg/（kg·d）吡格列酮對(duì)EPCs的作用較強(qiáng).【關(guān)鍵詞】吡格列酮；內(nèi)皮祖細(xì)胞；糖尿病0引言血管內(nèi)皮在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用，多種心血管疾病都伴有內(nèi)皮功能障礙.內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，在特定應(yīng)激條件下可分泌促血管生長(zhǎng)因子并參與內(nèi)皮修復(fù)和新生血管形成（包括血管新生和血管發(fā)生）［1］.研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者的EPCs增殖能力減退，體外黏附、形成毛細(xì)血管的能力也降低.吡格列酮是一種噻唑烷二酮類(lèi)胰島素增敏劑，對(duì)2型糖尿病有較好的降糖

4、效果和耐受性.研究［4］表明，吡格列酮可以促進(jìn)EPCs介導(dǎo)的新生血管形成，但具體作用機(jī)制不明.我們擬探討體外培養(yǎng)條件下，不同濃度吡格列酮預(yù)處理對(duì)正常大鼠的骨髓源性EPCs增殖、凋亡及功能的變化，為改善內(nèi)皮損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).1材料和方法1．1材料雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量70～80g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；M199培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；胎牛血清（美國(guó)Hyclon公司）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF，美國(guó)Biovision公司）；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，英國(guó)Peprotech公司）；乙?；兔芏戎鞍祝―iIacLDL，德國(guó)Invit

5、rogen公司）；胰島素和荊豆凝集素I（FITCUEAI，美國(guó)Sigma公司）；AC133和CD34（英國(guó)eBioscience公司）；flk1（美國(guó)Chemicon公司）；淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；NO檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所）；鹽酸吡格列酮（成都宇洋高科技發(fā)展有限責(zé)任公司）.1．2方法1．2．1實(shí)驗(yàn)分組及吡格列酮干預(yù)將大鼠隨機(jī)分為4組，每組6只，A組（對(duì)照組）給予9mL/L注射用生理鹽水，B，C，D組分別給予鹽酸吡格列酮10，20，40mg/（kg·d）.灌胃喂養(yǎng)10d.1．2．2分離培養(yǎng)EPCs頸椎脫臼法處死

6、大鼠，剝?nèi)テつw，取四肢置750mL/L乙醇5min；將骨兩端軟骨用無(wú)菌剪刀剪除，用M199培養(yǎng)液沖洗骨髓腔；將骨髓細(xì)胞懸液輕置于淋巴細(xì)胞分離液表面、離心并吸取乳白色單核細(xì)胞層，M199培養(yǎng)液洗滌后用含VEGF，bFGF的完全培養(yǎng)液重懸、計(jì)數(shù)并接種到培養(yǎng)瓶中，4h后將培養(yǎng)瓶翻面.1．2．3EPCs表型鑒定培養(yǎng)6d的細(xì)胞用2.5g/L胰酶和0.2g/L乙二胺四乙酸消化并接種于蓋玻片.24h后向細(xì)胞爬片孔內(nèi)加入10mg/LDiIacLDL100μL并置37℃孵育1h，多聚甲醛室溫固定10min，PBS漂洗后加入10mg/LFITCUEAI100μL，避光

7、孵育1h，PBS洗滌、晾干后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察.1．2．4NO檢測(cè)將培養(yǎng)4d的細(xì)胞消化、計(jì)數(shù)后以1.5×104/孔接種于96孔板培養(yǎng).按NO試劑盒說(shuō)明書(shū)，24h后于每孔吸上清100μL，采用硝酸還原酶法特異性將各孔上清液中NO3-還原為NO2-，并測(cè)定NO2-濃度，從而間接反映NO含量.1．2．5凋亡檢測(cè)將培養(yǎng)4d的細(xì)胞消化，不完全培養(yǎng)液(無(wú)血清)培養(yǎng)24h后加入含血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng).3d后再次消化貼壁細(xì)胞，以1000r/min離心5min后棄上清，行雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè).1．2．6增殖能力檢測(cè)分離EPCs并以1.5×104/孔接種96孔板.培養(yǎng)

8、7d后向每孔培養(yǎng)液中加入5g/LMTT溶液20μL，置孵育箱4h后