胎盤、臍血和骨髓來源的貼壁細胞的生物學特性的比較

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1、胎盤、臍血和骨髓來源的貼壁細胞的生物學特性的比較【摘要】　　目的探討人胎盤、臍血和骨髓來源的貼壁細胞的分離培養(yǎng)和生物學特性，為間充質干細胞(MSC)的選擇和應用提供依據(jù)。方法采用酶消化法分離人胎盤組織，60g/L羥乙基淀粉和密度梯度離心兩步法分離臍血單個核細胞，密度梯度離心法分離骨髓單個核細胞，分別進行貼壁培養(yǎng)，觀察不同來源MSC的生長、增殖和表面標志的表達并做比較。結果胎盤來源的貼壁細胞為一種混合性細胞，臍血單個核細胞體外培養(yǎng)可以獲得形態(tài)不均一的貼壁細胞，二者在生長規(guī)律和形態(tài)學特征上與骨髓基質相比有一定差異性，CD106、CD44在三種細胞均有表達。結論胎盤和臍血

2、來源的貼壁細胞具備間充質干細胞的基本特征?！娟P鍵詞】胎盤；臍血；間充質干細胞　　parisonoftheadherentcellsderivedfromhumanplacenta,umbilicalcordbloodandbonemarrohumanplacenta,umbilicalcordbloodandbonemarroesenchymalstemcells.MethodsAdherentcellshumanplacentatissuesbyenzymedigestion,andmononuclearcells(MNC)umbilicalcordblood(U

3、CB)by60g/LHESanddensitygradientcentrifugationandMNCbonemarrohumanplacentaandumbilicalcordbloodhaddisparateshapeinvitrorespectively.AndtheyhadsomedifferencesingrothosederivedfrombonemarrothethreetissuesallexpressedCD106andCD44inimmunohistochemistrystaining.ConclusionTheadherentcellsderi

4、vedfromhumanplacentaandumbilicalcordbloodhavethebasicfeaturesofmesenchymalstemcells.　　KEYSC)是成體干細胞之一，不僅支持造血系統(tǒng)，還具有多向分化潛能，在一定的實驗條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經(jīng)細胞、肌細胞、心肌細胞、肝細胞等[15]。因此，在細胞微環(huán)境和組織工程等方面具有廣泛的應用前景。近年來，已有具有干/祖細胞特征的間充質細胞自骨髓、外周血、軟骨、肌肉等組織中分離出來。這些組織均來源于胚胎發(fā)育期的中胚層，胎盤由滋養(yǎng)細胞及大量起源于中胚層的間充質和血管共同組

5、成，亦有報道從臍帶中分離培養(yǎng)出間充質干細胞[67]。因此，提示我們，與臍帶同為胎兒附屬物的胎盤中可能也含有MSC。本實驗試從胎盤和臍血中培養(yǎng)出類似于骨髓來源的間充質干細胞的貼壁細胞，并對這三種細胞進行形態(tài)學觀察，利用免疫細胞化學方法對其進行表面抗原的測定和比較，探討其作為MSC新來源的可行性?！　?材料與方法　　1.1材料胎盤、臍血均采自本院產(chǎn)房。供者要求是身體健康的產(chǎn)婦，胎兒發(fā)育良好。新鮮骨髓標本采自本院門診營養(yǎng)性貧血(骨髓呈增生象)患者。二氧化碳培養(yǎng)箱系美國謝爾登有限公司產(chǎn)品；SHELLAB1815TC型、胰蛋白酶、膠原酶、DNaseⅠ酶系Sigma公司產(chǎn)品

6、；牛血清白蛋白(BSA)系Roche公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)系杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；LDMEM為GIBCO公司產(chǎn)品；小鼠抗人CD34、CD45單克隆抗體，兔抗人CD44、CD106多克隆抗體由武漢博士德生物工程有限公司提供?！　?.2胎盤、骨髓來源貼壁細胞的分離培養(yǎng)在無菌條件下，剪取新鮮胎盤蛻膜層與羊膜層之間的絨毛組織，用含肝素的PBS反復沖洗，去除其血液成分。將絨毛膜層組織剪碎至約1mm×1mm×1mm大小，并盡可能去除肉眼可見的小血管及纖維連接成分，加入含2.5g/L胰蛋白酶、1g/L膠原酶Ⅳ、0.1g/LDNaseⅠ酶的LDMEM，于37

7、℃恒溫搖床內消化30min。消化產(chǎn)物經(jīng)200目無菌金屬濾網(wǎng)過濾，去除未消化的組織。過濾后的細胞懸液用PBS洗2次，然后進行細胞計數(shù)。骨髓液經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞并計數(shù)。臍血經(jīng)60g/L羥乙基淀粉和Ficoll密度梯度離心兩步法分離出單個核細胞并計數(shù)。　　以上三種來源的細胞計數(shù)后均用含100mL/L胎牛血清的LDMEM，在37℃、50mL/LCO2和飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁24-48h后，換液去除懸浮細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，每3-4d換液1次。待細胞80%-90%融合后，胰酶消化傳代。取3代以上傳代細胞部分用于細胞化學染色，部分細胞液氮凍存?zhèn)溆茫嗾哂糜?/p>