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《冰片對大鼠血小板胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、冰片對大鼠血小板胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度的影響【摘要】目的研究冰片對血小板內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響，以探討其抗血小板聚集作用的可能機制。方法采用雙波長Fura-2熒光法測定血小板胞漿內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)。結(jié)果在有無細胞外鈣存在時，冰片血清均能夠明顯抑制5-HT誘導的血小板胞內(nèi)［Ca2+］i升高（P<0.05）。結(jié)論冰片可抑制血小板聚集，其作用機制可能與其抑制血小板胞漿［Ca2+］i升高有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】冰片；血小板聚集；鈣；5-羥色胺ChinaAbstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectof
2、borneloncytoplasmicfreecalciumlevelinratplateletsanditspossiblemechanismofanti-plateletaggregation.MethodsPlatelet［Ca2+］iinedbydoublebeamfluorescencespectrophotometricmethod.ResultsS測定龍腦含量為56.20％，為合成冰片；Fura-2/AM由日本Dojindo公司提供，用二甲基亞砜（DMSO）溶解成1mmol/L，分裝，-20℃避光保存；二甲基亞砜（DMSO）、羥乙基哌嗪乙磺酸
3、（Hepes）均為Amersco公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白（BSA），由華美生物工程公司提供；Amresco公司產(chǎn)品；5-羥色胺硫酸肌酐，sigma公司產(chǎn)品，用0.1mol/LHCl溶液溶解后，用Tris-NaCl溶液調(diào)pH為7.4，分裝，-70℃避光凍存；乙二醇雙（2-氨基乙基）醚四乙酸（EGTA），MBCHEM公司產(chǎn)品，用新鮮配制的1mol/LNaOH配制成0.5mol/L的溶液（pH8.5）；TritonX-100，Amresco公司產(chǎn)品，用三蒸水配成20％的溶液；ACD溶液含檸檬酸鈉89mmol/L、檸檬酸16mmol/L、葡萄糖243mmol/L；無
4、Ca2+的Hepes緩沖液含NaCl140mmol/L、KCl3mmol/L、MgSO41mmol/L、Hepes10mmol/L、葡萄糖10mmol/L，用1mol/LNaOH調(diào)pH7.40；血小板負載液含NaCl140mmol/L、KCl3mmol/L、MgSO41mmol/L、Hepes10mmol/L、葡萄糖10mmol/L，0.4%BSA，用1mol/LNaOH調(diào)pH7.40，使用前預先通氧飽和；其它均為國產(chǎn)分析純，所有試劑均用新鮮制備的三蒸水配制?！ ?.3儀器LS-55熒光分光光度計，美國Perkin-Elmer公司產(chǎn)品。 2方法 2.1
5、冰片含藥血清的制備取雄性SD大鼠20只，隨機分為冰片組和溶劑對照組，每組10只。冰片組灌服冰片粟米油溶液（1.5g·kg-1）15ml·kg-1，給藥1次，藥后30min，腹主動脈取血，400r/min離心15min，分離血清，56℃水浴30min滅活，得冰片血清，置-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｈ軇φ战M給等容量的粟米油，按上述方法制備空白血清。應用氣相色譜法測得冰片血清中含冰片12.16μg·mL-1?！ ?.2水洗大鼠血小板懸液制備大鼠以10％水合氯醛35mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉，腹主動脈穿刺取血8ml，用ACD溶液以1∶5（ACD∶血）的比例抗凝，在(
6、20±2)℃下76×g離心15min，吸取上層富含血小板血漿（PRP），再將PRP在(20±2)℃下以500×g離心5min，棄上清，得血小板沉淀，用無Ca2+的Hepes緩沖液洗1次，450×g離心5min，棄上清，用無Ca2+的Hepes緩沖液懸浮。臺朌藍排斥試驗檢查細胞活性，活細胞率>90%?！ ?.3Fura-2/AM負載取1ml血小板懸液與1ml血小板負載液，5μmol/LFura-2/AM混勻，使得Fura-2/AM在血小板懸液中的終濃度為2.5μmol/L，37℃水浴避光孵育40min，立即離心，棄上清，沉淀以無Ca2+Hepes緩沖液
7、洗兩次，再用無Ca2+Hepes緩沖液重新懸浮，調(diào)整血小板濃度為300～400×109個plt/L待測?！ ?.4分組及給藥負載后的血小板懸液分為3組，分別是空白血清組、冰片血清低濃度組、冰片血清高濃度組。各組均于測定前用相應的空白血清或冰片含藥血清37℃孵育10min后，進行熒光測定?！ ?.5熒光強度測定［1，2］取負載的血小板懸液37℃溫孵5min，在PELS-55型熒光分光光度計上做熒光測定，固定發(fā)射波長為510nm，掃激發(fā)波長，如激發(fā)波長波峰由380nm移至340nm，則表明Fura-2/AM已負載酯解進入細胞內(nèi)。采用FFA模塊的改變波長的時間掃
8、描，激發(fā)波長分別固定在340nm、380nm，波寬5nm，發(fā)射波長
