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1、第十七章?分子標(biāo)記輔助選擇育種????傳統(tǒng)的育種主要依賴(lài)于植株的表現(xiàn)型選擇(Phenotypieal?selection)。環(huán)境條件、基因間互作、基因型與環(huán)境互作等多種因素會(huì)影響表型選擇效率。例如抗病性的鑒定就受發(fā)病的條件、植株生理狀況、評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)等影響；品質(zhì)、產(chǎn)量等數(shù)量性狀的選擇、鑒定工作更困難。一個(gè)優(yōu)良品種的培育往往需花費(fèi)7～8年甚至十幾年時(shí)間。如何提高選擇效率，是育種工作的關(guān)鍵。育種家在長(zhǎng)期的育種實(shí)踐中不斷探索運(yùn)用遺傳標(biāo)記來(lái)提高育種的選擇效率與育種預(yù)見(jiàn)性。遺傳標(biāo)記包括形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記與分子標(biāo)記。棉花的芽黃、番茄的葉
2、型、抗TMV的矮黃標(biāo)記、水稻的紫色葉鞘等形態(tài)性狀標(biāo)記，在育種工作中曾得到一定的應(yīng)用。以非整倍體、缺失、倒位、易位等染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)變異為基礎(chǔ)的細(xì)胞學(xué)標(biāo)記，在小麥等作物的基因定位、連鎖圖譜構(gòu)建、染色體工程以及外緣基因鑒定中起到重要的作用，但許多作物難以獲得這類(lèi)標(biāo)記。生化標(biāo)記主要是利用基因的表達(dá)產(chǎn)物如同工酶與貯藏蛋白，在一定程度上反映基因型差異。它們?cè)谛←?、玉米等作物遺傳育種中得到應(yīng)用。但是它們多態(tài)性低，且受植株發(fā)育階段與環(huán)境條件及溫度、電泳條件等影響，難以滿足遺傳育種工作需要。以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，目前已在作物遺傳圖譜構(gòu)建、重
3、要農(nóng)藝性狀基因的標(biāo)記定位、種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析與品種指紋圖譜及純度鑒定等方面得到廣泛應(yīng)用，尤其是分子標(biāo)記輔助選擇(molecularmarker-as—sisted?selection，MAS)育種更受到人們的重視。第一節(jié)?分子標(biāo)記的類(lèi)型和作用原理一、分子標(biāo)記的類(lèi)型和特點(diǎn)????按技術(shù)特性，分子標(biāo)記可分為三大類(lèi)。第一類(lèi)是以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)，主要有限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Restrictionfragmentlength?polymorphisms，RFLP標(biāo)記)；第二類(lèi)是以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase?ch
4、ainreaction，PCR反應(yīng))為基礎(chǔ)的各種DNA指紋技術(shù)。PCR是Mullis等(1985)首創(chuàng)的在模板DNA、引物和4種脫氧核糖核苷酸存在的條件下，依賴(lài)于DNA聚合酶的體外酶促反應(yīng)，合成特異DNA片段的一種方法。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板DNA的特異結(jié)合。PCR反應(yīng)分變性(denaturation)、復(fù)性(annealling)、延伸(exten—sion)三步(圖17—1)。變性指的是通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA的過(guò)程；復(fù)性(又稱(chēng)退火)是指當(dāng)溫度降低時(shí)，單鏈DNA回復(fù)形成雙鏈的過(guò)程，由于模
5、板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜得多，而且反應(yīng)體系中引物DNA大大高于模板DNA，容易使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈；延伸是指在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的條件下，在聚合酶催化下進(jìn)行以引物為起始點(diǎn)的5'-3'的DNA鏈延伸。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物可以作為下一個(gè)循環(huán)的模板，經(jīng)25～30個(gè)循環(huán)后，介于兩個(gè)引物之間的特異DNA片段得到大量的復(fù)制，數(shù)量可達(dá)2×106-7拷貝。按照PCR所需引物類(lèi)型又可分為：①單引物PCR標(biāo)記，其多態(tài)性來(lái)源于單個(gè)隨機(jī)引物作用下擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度或序列的變異，包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA
6、標(biāo)記(Random別amplificationpolymorphismDNA，RAPD)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列中間區(qū)域標(biāo)記(1nter-simplesequencerepeats?polymorphisms，ISSR)等技術(shù)；②雙引物選擇性擴(kuò)增的PCR標(biāo)記，主要通過(guò)引物3'端堿基的變化獲得多態(tài)性，這種標(biāo)記主要指擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP)；③需要通過(guò)克隆、測(cè)序來(lái)構(gòu)建特殊雙引物的PCR標(biāo)記如簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記(Simplesequencerepeats，SSR)、序列
7、特征化擴(kuò)增區(qū)域(Segion，簡(jiǎn)稱(chēng)SCAR技術(shù))和序標(biāo)位(Sequence—taggedsites，簡(jiǎn)稱(chēng)STS)等。第三類(lèi)是一些新型的分子標(biāo)記，如單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入／缺失等。表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressedsequencestags，EST)是在cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆，并進(jìn)行單邊測(cè)序(Singlepass?sequence)而產(chǎn)生的300～500bp的核苷酸片段。應(yīng)用于分子標(biāo)記輔
8、助育種的標(biāo)記主要有RFLP、RAPD、SSR、AFLP、STS等。它們的遺傳、表現(xiàn)特點(diǎn)總結(jié)于表17—1。????分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，因而具有以下優(yōu)點(diǎn)：①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無(wú)組織器官、發(fā)育時(shí)
