分子標(biāo)記的發(fā)展及分子標(biāo)記輔助育種

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1、分子標(biāo)記的發(fā)展及分子標(biāo)記輔助育種分子標(biāo)記輔助選擇育種(MarkerAssistedSelection(MAS)或MarkerAssistedBreeding)是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記或功能標(biāo)記），在雜交后代中準(zhǔn)確地對不同個體的基因型進行鑒別，并據(jù)此進行輔助選擇的育種技術(shù)。通過分子標(biāo)記檢測，將基因型與表現(xiàn)型相結(jié)合，應(yīng)用于育種各個過程的選擇和鑒定，可以顯著提高育種選擇工作的準(zhǔn)確性，提高育種研究的效率。分子標(biāo)記輔助育種示意圖DNA分子標(biāo)記相對同類技術(shù)來說具有很強的優(yōu)越性：因為大部分標(biāo)記為共顯性，對隱性性狀的選擇

2、十分有利；數(shù)量極多，應(yīng)對極其豐富的基因組變異；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用標(biāo)記分析；不影響目標(biāo)性狀的表達，與不良性狀無必然的連鎖等等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在DNA分子標(biāo)記技術(shù)也有數(shù)十種，廣泛應(yīng)用于遺傳育種、基因組作圖、基因定位、物種親緣關(guān)系鑒定、基因庫構(gòu)建、基因克隆等方面。分子標(biāo)記的類型分子標(biāo)記按技術(shù)特性可分為三大類。第一類是以分子雜交為基礎(chǔ)的DNA標(biāo)記技術(shù)，主要有限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP標(biāo)記)；第二類是

3、以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerasechainreaction，PCR反應(yīng))為基礎(chǔ)的各種DNA指紋技術(shù)；第三類是一些新型的分子標(biāo)記，如單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)，由基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入／缺失等。分子標(biāo)記是以DNA多態(tài)性為基礎(chǔ)，因而具有以下優(yōu)點：①表現(xiàn)穩(wěn)定，多態(tài)性直接以DNA形式表現(xiàn)，無組織器官、發(fā)育時期特異性，不受環(huán)境條件、基因互作影響；②數(shù)量多，理論上遍及整個基因組；③多態(tài)性高，自然界存在許

4、多等位變異，無需專門人為創(chuàng)造特殊遺傳材料，這為大量重要性狀基因緊密連鎖的標(biāo)記篩選創(chuàng)造了條件；④對目標(biāo)性狀表達無不良影響，與不良性狀無必然連鎖；⑤部分標(biāo)記遺傳方式為共顯性，可鑒別純合體與雜合體；⑥成本不高，一般實驗室均可進行。對于特定探針或引物可引進或根據(jù)發(fā)表的特定序列自行合成。各種分子標(biāo)記的原理和優(yōu)缺點第一代分子標(biāo)記：RFLPRFLP在20世紀(jì)70年代已被發(fā)現(xiàn)，是發(fā)現(xiàn)最早的一種分子標(biāo)記。1980年，人類首先將其用于構(gòu)建連鎖圖。RFLP標(biāo)記的原理：植物基因組DNA上的堿基替換、插入、缺失或重復(fù)等，造成某種限制性內(nèi)切酶

5、(restrictionenzymes，簡稱RE)酶切位點的增加或喪失是產(chǎn)生限制性片段長度多態(tài)性的原因。對每一個DNA／RE組合而言，所產(chǎn)生的片段是特異性的，它可作為某一DNA所特有的“指紋”。某一生物基因組DNA經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化后，能產(chǎn)生數(shù)百萬條DNA片段，通過瓊脂糖電泳可將這些片段按大小順序分離，然后將它們按原來的順序和位置轉(zhuǎn)移至易于32操作的尼龍膜或硝酸纖維素膜上，用放射性同位素(如P)或非放射性物質(zhì)(如生物素、地高辛等)標(biāo)記的DNA作為探針，與膜上的DNA進行雜交(即Southern雜交)，若某一位置上的

6、DNA酶切片段與探針序列相似，或者說同源程度較高，則標(biāo)記好的探針就結(jié)合在這個位置上。放射自顯影或酶學(xué)檢測后，即可顯示出不同材料對該探針的限制性片段多態(tài)性情況。對于線粒體和葉綠體等相對較小的DNA分子，通過合適的限制性內(nèi)切酶酶切，電泳分析后有可能直接檢測出DNA片段的差異，就不需Southern雜交。RFLP探針主要有三種來源，即cDNA克隆、植物基因組克隆(RandomGenome克隆，簡稱RG克隆)和PCR克隆。優(yōu)點:RFLP標(biāo)記具有共顯性的特點。共顯性(co-dominant)標(biāo)記指的是雙親的兩個以上分子量不同

7、的多態(tài)性片段均在F1中表現(xiàn)。它已被廣泛用于多種生物的遺傳分析，特別是構(gòu)建植物遺傳圖譜。缺點：RFLP分析的探針，必須是單拷貝或寡拷貝的，否則，雜交結(jié)果不能顯示清晰可辨的帶型，表現(xiàn)為彌散狀，不易進行觀察分析。RFLP標(biāo)記所需DNA量大，檢測步驟繁瑣，需要的儀器、設(shè)備較多，周期長，檢測少數(shù)幾個探針時成本較高，用作探針的DNA克隆其制32備與存放較麻煩；檢測中要利用放射性同位素(通常為P)，易造成污染。盡管非放射性物質(zhì)標(biāo)記方法可用，但價格高，雜交信號相對較弱，靈敏度也較同位素標(biāo)記低。目前，RFLP標(biāo)記直接用于育種成本高，

8、逐漸被第二代、第三代分子標(biāo)記取代。第二代分子標(biāo)記：基于PCR技術(shù)的RAPD/SCAR/AFLP/SSRRAPD標(biāo)記由Williams等(1990)以DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)為基礎(chǔ)而提出。RAPD標(biāo)記的原理RAPD標(biāo)記是用隨機排列的寡聚脫氧核苷酸單鏈引物(長度為10個核苷酸)通過PCR擴增染色體組中的DNA所獲得的長度不同的多態(tài)性DNA片段。RAPD標(biāo)記的原理同P