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1、用積分法考察黃嘌呤對(duì)Candidaspecies尿酸酶的抑制作用論文【關(guān)鍵詞】尿酸酶CharacterizationofinhibitionofxanthineonCandidaspeciesuricasebyintegratedmethod【Abstract】AIM:Toinvestigatetheprerequisiteoftheintegratedmethodforcharacterizinginhibitorsodel.METHODS:Uricasereactioncurveonitoredbyabsorbanceat293nm.Theapparentkiic
2、parameters(apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp,andapparentmaximalreactionrate,Vmapp)atedbynonlinearfittingreactioncurvetotheintegratedMichaelisMentenrateequatione.Theinhibitiontypeandinhibitionconstant(Ki)inedbasedontheresponsesofapparentkiicparameterstoxanthineconcentrations.RESULTS:
3、Outliersinreactioncurvegreatlyreducedthereliabilityofparametersobtainedbythisintegratedmethod.ichaelisMentenconstant,Kmapp)和表觀最大反應(yīng)速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp).據(jù)上述參數(shù)隨抑制劑濃度的變化確定抑制類型和抑制常數(shù)(inhibitionconstant,Ki).結(jié)果:被分析數(shù)據(jù)中的畸異值顯著降低結(jié)果可靠性.通常終點(diǎn)底物1/6Kmapp而起始底物足夠高，此積分法測(cè)定Kmapp的偏差和變異低于20％而V
4、mapp精度更高.用積分法所得Kmapp與雙倒數(shù)法一致，且和黃嘌呤濃度成正比，對(duì)應(yīng)Ki為(5.4±0.8)μmol/L(n=3)，也與雙倒數(shù)法一致.結(jié)論:被分析數(shù)據(jù)精度足夠高，用無(wú)抑制劑時(shí)米氏常數(shù)（MichaelisMentenconstant,Km）4倍以上的起始底物濃度并固定終點(diǎn)底物濃度1/6Km，此積分法能用于篩選特殊類型的抑制劑.【關(guān)鍵詞】積分法；雙倒數(shù)分析法；尿酸酶；黃嘌呤；米氏常數(shù)；抑制常數(shù)0引言酶抑制劑是新藥開發(fā)熱點(diǎn).通常據(jù)表觀米氏常數(shù)（apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp）和表觀最大反應(yīng)速度（apparentmax
5、imalreactionrate,Vmapp）隨抑制劑濃度變化同步確定抑制類型和抑制常數(shù)（inhibitionconstant,.freelapp和Vmapp篩選抑制劑需要底物濃度分布在米氏常數(shù)(MichaelisMentenconstant,Km)兩側(cè).freel和最大反應(yīng)速度(maximalreactionrate,Vm).經(jīng)典積分法所用積分速度方程自變量缺乏統(tǒng)計(jì)合理性，所得參數(shù)可靠性低［2］.最近發(fā)現(xiàn)用以反應(yīng)時(shí)間為自變量的積分速度方程擬合酶反應(yīng)曲線，能可靠測(cè)定酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)并篩選抑制劑［3-7］.此積分法篩選抑制劑對(duì)初始底物濃度誤差不敏感，且效率高而成本低.我們用
6、此積分法考察黃嘌呤對(duì)Candidaspecies尿酸酶的抑制作用，以期進(jìn)一步明確此法篩選抑制劑的可靠性和應(yīng)用條件.1材料和方法1.1材料尿酸、黃嘌呤購(gòu)自I,Candidaspecies尿酸酶(E.C1.7.3.3)購(gòu)自Sigma［U0880］.其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純.1.2方法緩沖液含100μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］.反應(yīng)體系含1.0mL緩沖液，底物、抑制劑和酶液共0.20mL.用雙倒數(shù)法分析時(shí)，酶為0.083μkat/L，記錄反應(yīng)延遲30s后反應(yīng)1min內(nèi)的數(shù)據(jù).積分法分析時(shí)，酶為0.333μkat/L，初始底物濃度為55μmol/L，在(25±0.5)
7、℃以10s間隔記錄啟動(dòng)反應(yīng)40s后底物消耗到1/8Kmapp(雙倒數(shù)法測(cè)定)的反應(yīng)曲線.用線性回歸確定雙倒數(shù)法所得參數(shù).積分法測(cè)定參數(shù)按以前方法分析啟動(dòng)反應(yīng)40s后光吸收變化0.001的6個(gè)以上數(shù)據(jù)［7］.用VisualBasic6.0編寫程序，數(shù)據(jù)記錄成文件讀入，作圖鑒別畸異值，結(jié)果輸出到指定文件.線性回歸分析Kmapp及1/Vmapp隨抑制劑濃度的變化確定對(duì)應(yīng)的抑制常數(shù).根據(jù)兩種抑制常數(shù)的統(tǒng)計(jì)有效性和相對(duì)大小確定抑制類型［8］.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：結(jié)果用x±s表示，用SAS8.2分折數(shù)據(jù)，P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.2結(jié)果雙倒數(shù)法分析無(wú)抑制劑時(shí)9～70μm
