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1、用積分法考察黃嘌呤對Candidaspecie【關鍵詞】尿酸酶CharacterizationofinhibitionofxanthineonCandidaspeciesuricasebyintegratedmethod 【Abstract】AIM:Toinvestigatetheprerequisiteoftheintegratedmethodforcharacterizinginhibitorsodel.METHODS:Uricasereactioncurveonitoredbyabsorbancea
2、t293nm.Theapparentkiicparameters(apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp,andapparentmaximalreactionrate,Vmapp)atedbynonlinearfittingreactioncurvetotheintegratedMichaelisMentenrateequatione.Theinhibitiontypeandinhibitionconstant(Ki)inedbasedontheresponsesofap
3、parentkiicparameterstoxanthineconcentrations.RESULTS:Outliersinreactioncurvegreatlyreducedthereliabilityofparametersobtainedbythisintegratedmethod.ichaelisMentenconstant,Kmapp)和表觀最大反應速度(apparentmaximalreactionrate,Vmapp).據上述參數隨抑制劑濃度的變化確定抑制類型和抑制常數(inhibitio
4、nconstant,Ki).結果:被分析數據中的畸異值顯著降低結果可靠性.通常終點底物<1/6Kmapp而起始底物足夠高，此積分法測定Kmapp的偏差和變異低于20％而Vmapp精度更高.用積分法所得Kmapp與雙倒數法一致，且和黃嘌呤濃度成正比，對應Ki為(5.4±0.8)μmol/L(n=3)，也與雙倒數法一致.結論:被分析數據精度足夠高，用無抑制劑時米氏常數（MichaelisMentenconstant,Km）4倍以上的起始底物濃度并固定終點底物濃度<1/6Km，此積分法能用于篩選特殊類
5、型的抑制劑. 【關鍵詞】積分法；雙倒數分析法；尿酸酶；黃嘌呤；米氏常數；抑制常數 0引言 酶抑制劑是新藥開發(fā)熱點.通常據表觀米氏常數（apparentMichaelisMentenconstant,Kmapp）和表觀最大反應速度（apparentmaximalreactionrate,Vmapp）隨抑制劑濃度變化同步確定抑制類型和抑制常數（inhibitionconstant,Ki）篩選抑制劑［1］.雙倒數法測定Kmapp和Vmapp篩選抑制劑需要底物濃度分布在米氏常數(MichaelisMenten
6、constant,Km)兩側，且范圍應盡量寬.此法測定動力學參數對低濃度底物下初速度誤差和底物濃度本身的誤差都非常敏感，用于篩選抑制劑的成本也很高.用積分速度方程酶反應曲線，即積分法，可同步確定Km和最大反應速度(maximalreactionrate,Vm).經典積分法所用積分速度方程自變量缺乏統(tǒng)計合理性，所得參數可靠性低［2］.最近發(fā)現用以反應時間為自變量的積分速度方程擬合酶反應曲線，能可靠測定酶動力學參數并篩選抑制劑［3-7］.此積分法篩選抑制劑對初始底物濃度誤差不敏感，且效率高而成本低.我們用此積分
7、法考察黃嘌呤對Candidaspecies尿酸酶的抑制作用，以期進一步明確此法篩選抑制劑的可靠性和應用條件. 1材料和方法 1.1材料 尿酸、黃嘌呤購自I,Candidaspecies尿酸酶(E.C1.7.3.3)購自Sigma［U0880］.其余試劑為國產分析純. 1.2方法 緩沖液含100μmol/L二乙基三氨基五乙酸［6,7］.反應體系含1.0mL緩沖液，底物、抑制劑和酶液共0.20mL.用雙倒數法分析時，酶為0.083μkat/L，記錄反應延遲30s后反應1min內的數據.積分法分析時，酶
8、為0.333μkat/L，初始底物濃度為55μmol/L，在(25±0.5)℃以10s間隔記錄啟動反應40s后底物消耗到<1/8Kmapp(雙倒數法測定)的反應曲線.用線性回歸確定雙倒數法所得參數.積分法測定參數按以前方法分析啟動反應40s后光吸收變化>0.001的6個以上數據［7］.用VisualBasic6.0編寫程序，數據記錄成文件讀入，作圖鑒別畸異值，結果輸出到指定文件.線性回歸分析Kmapp
