質(zhì)粒重組體在體轉(zhuǎn)染大鼠心肌的可行性

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1、質(zhì)粒重組體在體轉(zhuǎn)染大鼠心肌的可行性作者：郭敏，郎明健，曾秋棠，楊漢東，閔新文【摘要】目的：探討應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000在體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒重組體基因至大鼠心肌的可行性.方法：構(gòu)建含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因的真核表達(dá)質(zhì)粒.將22只雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：陰性對照組（Ⅰ組，n=4），心肌注射組（Ⅱ組,n=6），尾靜脈注射組(Ⅲ組，n=6)和冠狀動脈灌注組（Ⅳ組，n=6）.分別采用心肌局部注射、尾靜脈液壓注射、冠狀動脈灌注三種不同方式實施在體心肌轉(zhuǎn)染.Ⅱ～Ⅳ組于轉(zhuǎn)染后2，14d時間點各隨機(jī)處死3只大鼠，陰性對照組各處死2只大鼠,取心肌組織作快速冰凍切片，熒光顯

2、微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況.結(jié)果：在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達(dá)情況，陰性對照組隱約可見淡綠色熒光，第2天各轉(zhuǎn)染組均可見明顯的綠色熒光分布于所取心臟組織.各轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度與陰性對照組相比,其差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).心肌注射組和尾靜脈注射組間熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.17）.冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染組熒光強(qiáng)度較其余兩組增強(qiáng)7.37倍（P=0.013）.第2周轉(zhuǎn)染各組熒光強(qiáng)度明顯減弱，與陰性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.41).結(jié)論：陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000可有效的將質(zhì)粒重組體通過各種方式轉(zhuǎn)染心肌組織，而通過冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染可以明顯提高其轉(zhuǎn)染效率.

3、【關(guān)鍵詞】脂質(zhì)體；心肌；轉(zhuǎn)染；質(zhì)粒；綠色熒光蛋白質(zhì)類0引言　　基因治療為心血管疾病的治療帶來了新的希望［1］，如何高效、穩(wěn)定、安全地將目的基因轉(zhuǎn)染到心肌組織是基因治療中的關(guān)鍵問題.目前，外源基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞的方法大致有生物方法和物理化學(xué)方法2種.前者主要以病毒為載體，外源基因在宿主細(xì)胞中能長期表達(dá)，屬當(dāng)前基因治療中首選的基因轉(zhuǎn)染方式，但其安全性差、缺乏靶向性等缺點使其應(yīng)用受到很大限制.后者包括磷酸鈣法、顯微注射、電穿孔等,因其操作方法限制，不適于大量細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及基因治療的在體研究［2］.陽離子脂質(zhì)體是一種非病毒制劑，由于其具有轉(zhuǎn)染效率相對較高、操作簡易、可大規(guī)模轉(zhuǎn)染及不引起特異性免

4、疫反應(yīng)等優(yōu)點受到大家的關(guān)注.本研究應(yīng)用陽離子脂質(zhì)體lipofectamine2000將質(zhì)粒重組體通過局部心肌注射、尾靜脈注射、冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染3種途徑轉(zhuǎn)染至心肌組織，并比較其轉(zhuǎn)染效率，為今后進(jìn)行心肌組織在體轉(zhuǎn)染的研究提供方法學(xué)參考.1材料和方法1.1材料SD雄性大鼠22只，體質(zhì)量150～200g,購自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心.pGenesil1質(zhì)粒及感受態(tài)細(xì)胞DH5а購自武漢市晶賽生物工程技術(shù)有限公司，lipofectamineTM2000及OMEM培養(yǎng)基購自Invitrogen.1.2方法1.2.1pGenesil1質(zhì)粒重組體的構(gòu)建質(zhì)粒重組體pGenesil1的構(gòu)建參

5、考A：陰性對照組；B：心肌注射組；C：尾靜脈注射組；D：冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染組；E：冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染組升主動脈.圖1轉(zhuǎn)染2d時各轉(zhuǎn)染組EGFP的表達(dá)×100A：陰性對照組；B：心肌注射組；C：尾靜脈注射組；D：冠狀動脈灌注轉(zhuǎn)染組；aP<0.05vs陰性對照組;bP<0.05vs心肌注射組和尾靜脈注射組.圖2各轉(zhuǎn)染組平均熒光強(qiáng)度比較最初基因治療的途徑集中于局部注射于靶器官.早在1990年，alone,RS,MorleG,etal.ExpressionofrebinantgenesinmyocardiuminvivoafterdirectinjectionofDNA［J］.Circ

6、ulation,1990,82(6):2217-2221.［9］LiuD,KnappJE.Hydrodynamicsbasedgenedelivery［J］.CurrOpinMolTher,2001,3(2):192-197.［10］BudkerV，BudkerT，ZhangG,etal.Hypothesis:nakedplasmidDNAistakenupbycellsinvivobyareceptormediatedprocess［J］．GeneMed,2000,2(2)：76-88.［11］MiaoolCellCardiol,2000,32(12):2397-2402.［12

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