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《實時熒光定量-原理-taqman-探針簡介》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、實時熒光定量PCR技術原理與應用聚合酶鏈式反應(PCR)可對特定核苷酸片斷進行指數級的擴增。在擴增反應結束之后，我們可以通過凝膠電泳的方法對擴增產物進行定性的分析，也可以通過放射性核素摻入標記后的光密度掃描來進行定量的分析。無論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產物。但是在許多情況下，我們所感興趣的是未經PCR信號放大之前的起始模板量。例如我們想知道某一轉基因動植物轉基因的拷貝數或者某一特定基因在特定組織中的表達量。在這種需求下熒光定量PCR技術應運而生。所謂的實時熒光定量PCR就是通過對PCR擴增反應中每一個循環(huán)產物熒光信號的實時
2、檢測從而實現對起始模板定量及定性的分析。在實時熒光定量PCR反應中，引入了一種熒光化學物質，隨著PCR反應的進行，PCR反應產物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線圖(如圖1)。圖1實時熒光擴增曲線圖一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產物量的變化。而在平臺期，擴增產物已不再呈指數級的增加。PCR的終
3、產物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據最終的PCR產物量不能計算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量PCR技術中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和CT值。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環(huán)數被稱為CT值（thresho
4、ldvalue）（如圖2所示）。圖2.熒光定量標準曲線CT值與起始模板的關系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代表Ct值（如圖3所示）。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。圖3閾值線和CT值熒光探針和熒光染料實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩種，探針類是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴增產物的增加，非探針類則是利用熒光染料或者特殊設計的引物來
5、指示擴增的增加。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行。TaqMan探針TaqMan探針是多人擁有的專利技術。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，它的熒光與目的序列的擴增相關。它設計為與目標序列上游引物和下游引物之間的序列配對。熒光基團連接在探針的5’末端，而淬滅劑則在3’末端。當完整的探針與目標序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3’端的淬滅劑接近而被淬滅。但在進行延伸反應時，聚合酶的5’外切酶活性將探針進行酶切，使得熒光基團與淬滅劑分離。TaqMan探針適合于各種耐熱的聚合酶，如DyNAzymeTMIIDNA聚合
6、酶（MJResearch公司有售）。隨著擴增循環(huán)數的增加，釋放出來的熒光基團不斷積累。因此熒光強度與擴增產物的數量呈正比關系。
