資源描述：
《實時熒光定量PCR原理》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、實時熒光定量PCR原理與應(yīng)用提綱?PCR?定量PCR?熒光化學(xué)監(jiān)測物質(zhì)?實時熒光定量PCR應(yīng)用PCR目的及背景?多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction)簡稱ＰＣＲ技術(shù)，是８０年代中期發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異ＤＮＡ片段的技術(shù)。此法操作簡便，可在短時間內(nèi)在試管中獲得數(shù)百萬個特異的目的ＤＮＡ序列的拷貝.?分子克隆，目的基礎(chǔ)檢測，遺傳病的基因診斷，法醫(yī)學(xué)，考古學(xué)等方面得到了廣泛的應(yīng)用。?ＰＣＲ技術(shù)實際上是在模板ＤＮＡ，引物和４種脫氧核苷酸存在的條件下依賴于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反應(yīng)，ＰＣＲ技術(shù)的特異性取決于引物和模板ＤＮＡ結(jié)合的特異性。反應(yīng)分三步：①變
2、性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（extension），反應(yīng)過程見圖。傳統(tǒng)PCR傳統(tǒng)PCR傳統(tǒng)PCR傳統(tǒng)PCR通過凝膠電泳對終產(chǎn)物進(jìn)行定性分析(30cycles)PCR:理論vs.實際Theoretic?Intheory,PCRreactionsalamplifyexponentially,increasedoublingeverycycleandgrowforever.RealityLogTargetDNA?Inreality,Cycle#提綱?PCR?定量PCR?熒光化學(xué)監(jiān)測物質(zhì)?實時熒光定量PCR應(yīng)用定量PCR?通過Ct值和標(biāo)
3、準(zhǔn)曲線實現(xiàn)對起始模板的定量分析模板FCycle1F2X模板F本底期、指數(shù)擴(kuò)增期、平臺期Cycle2LinearLogViewViewFF熒光檢測4X模板FFF熒光監(jiān)測化學(xué)物質(zhì)30-40循環(huán)熒光閾值與Ct值?熒光閾值：在熒光擴(kuò)增曲線指數(shù)增長期設(shè)定一個熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)(即PCR擴(kuò)增產(chǎn)物量的標(biāo)準(zhǔn))?Ct值的定義是PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物(熒光信號）到達(dá)閾值時（進(jìn)入指數(shù)增長期）所經(jīng)過的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t)valueC(t)value18.12+/-0.04Thresholdline標(biāo)準(zhǔn)曲線108標(biāo)準(zhǔn)曲線108106標(biāo)準(zhǔn)曲線108106104標(biāo)準(zhǔn)曲線108106104102標(biāo)準(zhǔn)曲
4、線108106104102T標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線108106104102T標(biāo)準(zhǔn)曲線105copies/well定量PCR優(yōu)點?定量：對初始模板的絕對定量?優(yōu)點：更靈敏，寬廣的動力學(xué)范圍?污染機(jī)會少：閉管化學(xué)?沒有后處理：不用雜交、電泳、拍照?操作簡單：高度自動化?用途廣泛：既能定量又能定性?靈活：既可多點測定，又可單點測定提綱?PCR?定量PCR?熒光化學(xué)監(jiān)測物質(zhì)?實時熒光定量PCR應(yīng)用熒光化學(xué)物質(zhì)非特異性標(biāo)記特異性的熒光探針SYBRGreenITaqManEvaGreen分子信標(biāo)(Molecularbeacons)SYBRGreenISYBRGreenISYBRGree
5、nISYBRGreenISYBRGreenI?使用方便，只需要一對引物－－不必設(shè)計復(fù)雜的熒光探針?熔解曲線－－鑒定PCR有無雜帶、引物二聚體?便宜?靈敏?無模板特異性－－不能分辨非特異產(chǎn)物?不能做復(fù)合PCR擴(kuò)增融解曲線反應(yīng)程序1、融解曲線在定量PCR反應(yīng)完成之后2、軟件自動分析結(jié)果，生成融解曲線圖譜融解曲線分析-原始圖譜融解曲線分析-導(dǎo)數(shù)圖譜TAQMAN探針TAQMAN探針TAQMAN探針TaqMan探針小結(jié)?對目標(biāo)序列有很高的特異性---特別適合于SNP檢測?可以在一個反應(yīng)中進(jìn)行兩個基因的定量?熒光強(qiáng)度與反應(yīng)物成正比?反應(yīng)成本較高?設(shè)計復(fù)雜提綱?PCR?定量PCR?
6、熒光化學(xué)監(jiān)測物質(zhì)?實時熒光定量PCR應(yīng)用定量PCR應(yīng)用I-實時定量DNA定量－拷貝數(shù)研究（替代SouthernBlot）–病原體定量檢測–轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測RNA定量－基因表達(dá)差異（替代NorthernBlot)單個或多個基因地表達(dá)譜分析–不同組織、器官–不同時期–不同處理定量PCR應(yīng)用II：終點讀板?基因突變分析–單基因遺傳病診斷，如血友病、地貧?SNP掃描–疾病相關(guān)基因鑒定，如牛皮癬、哮喘相關(guān)基因SNP的鑒定–SNP檢測與臨床表現(xiàn)的相關(guān)性，如抗高血壓藥物療效的個體差異–藥物副反應(yīng)的預(yù)防，如麻醉意外?物種鑒定、菌株鑒定–各種病毒，細(xì)菌，病毒–病原體檢測，如炭疽菌，E
7、coli.O157
