培養(yǎng)基的制備及滅菌

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1、實驗八培養(yǎng)基的制備與滅菌一、目的要求1.掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包扎方法。2.掌握培養(yǎng)基的配置方法。3.掌握干熱滅菌和高壓蒸汽滅菌的操作方法。二、基本原理正確掌握培養(yǎng)基的配制方法是從事微生物學(xué)實驗工作的重要基礎(chǔ)。由于微生物種類及代謝類型的多樣性．因而用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基的種類也很多，它們的配方及配制方法雖各有差異。但一般培養(yǎng)基的配制程序卻大致相同．例如器皿的準(zhǔn)備，培養(yǎng)基的配制與分裝，棉塞的制作，培養(yǎng)基的滅菌，斜面與平板的制作以及培養(yǎng)基的無菌檢查等基本環(huán)節(jié)大致相同。三、實驗材料1.藥品：待配各種培養(yǎng)基的組成成分、

2、瓊脂、1mol/L的NaOH和HCl溶液。2.儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、玻璃漏斗等。3.其他物品：藥匙、稱量紙、pH試紙、記號筆、棉花等。四、操作步驟（一）玻璃器皿的洗滌和包裝1．玻璃器皿的洗滌玻璃器皿在使用前必須洗刷干凈。將三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、量筒等浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然后用自來水及蒸餾水沖凈。移液管先用含有洗滌劑的水浸泡，再用自來水及蒸餾水沖洗。洗刷干凈的玻璃器皿置于烘箱中烘干后備用。2．滅菌前玻璃器皿的包裝（1）培養(yǎng)皿的包扎：培養(yǎng)皿由一蓋一底組成一套

3、，可用報紙將幾套培養(yǎng)皿包成一包，或者將幾套培養(yǎng)皿直接置于特制的鐵皮圓筒內(nèi)，加蓋滅菌。包裝后的培養(yǎng)皿須經(jīng)滅菌之后才能使用。圖8-1移液管的包扎（2）移液管的包扎：在移液管的上端塞入一小段棉花(勿用脫脂棉)，它的作用是避免外界及口中雜菌進(jìn)入管內(nèi)，并防止菌液等吸入口中。塞入此小段棉花應(yīng)距管口約0.5cm左右，棉花自身長度約1~1.5cm。塞棉花時．可用一外圍拉直的曲別針、將少許棉花塞入管口內(nèi)。棉花要塞得松緊適宜，吹時以能通氣而又不使棉花滑下為準(zhǔn)。先將報紙裁成寬約5cm左右的長紙條，然后將已塞好棉花的移液管尖端放在長條報紙的一端，約

4、成45℃角，折疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，有手將移液管壓緊．在桌面上向前搓轉(zhuǎn)，以螺旋式包扎起來。上端剩余紙條，折疊打結(jié)，準(zhǔn)備滅菌。（二）液體及固體培養(yǎng)基的配制過程1．液體培養(yǎng)基配制1)稱量：一般可用0.01g天平稱量配制培養(yǎng)基所需的各種藥品，先按培養(yǎng)基配方計算出各成分的用量．然后進(jìn)行準(zhǔn)確稱量。2)溶解：將稱好的藥品置于一燒杯中，先加入少量水(根據(jù)實驗需要可用自來水或蒸餾水)，用玻璃棒攪動，加熱溶解。3)定容：待全部藥品溶解后，倒入一量筒中，加水至所需體積。如某種藥品用量太少時，可預(yù)先配成較濃溶液，然后按比例吸取一定體

5、積溶液，加入至培養(yǎng)基中。4)調(diào)pH：一般用pH試紙測定培養(yǎng)基的pH。用剪刀剪出一小段pH試紙，然后用鑷子夾取此段pH試紙，在培養(yǎng)基中蘸一下，觀看其pH范圍，如培養(yǎng)基偏酸或偏堿時，可用1mol/LNaoH或1mol/LHCl溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)pH時，應(yīng)逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部過酸或過堿，破壞培養(yǎng)基中成分。邊加邊攪拌，并不時用pH試紙測試，直至達(dá)到所需pH為止。5)過濾：用濾紙或多層紗布過濾培養(yǎng)基。一般無特殊要求時，此步可省去。2．固體培養(yǎng)基的配制配制固體培養(yǎng)基時，應(yīng)將已配好的液體培養(yǎng)基加熱煮沸，再將稱好的瓊脂(1

6、.5~2％)加入，并用玻棒不斷攪拌，以免糊底燒焦。繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化，最后補(bǔ)足因蒸發(fā)而失去水分。（三）培養(yǎng)基的分裝根據(jù)不同需要，可將已配好培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)，分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾污管口或瓶口，造成污染。如操作不小心，培養(yǎng)基沾污管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養(yǎng)基，并將脫脂棉棄去。1．試管的分裝取一個玻璃漏斗，裝在鐵架上，漏斗下連一根橡皮管，橡皮管下端再與另一玻璃管相接，橡皮管的中部加一彈簧夾。分裝時，用左手拿住空試管中部，并將漏斗下的玻璃管嘴插入試管內(nèi)，以右手拇指及食指開放彈簧夾，中指

7、及無名指夾佐玻璃管嘴，使培養(yǎng)基直接流入試管內(nèi)。裝入試管培養(yǎng)基的量視試管大小及需要而定，若所用試管大小為15×150mm時，液體培養(yǎng)基可分裝至試管高度1／4左有為宜；如分裝固體或半固體培養(yǎng)基時，在瓊脂完全融化后，應(yīng)趁熱分裝于試管中。用于制作斜面的固體培養(yǎng)基的分裝量為管高1／5(約3—4mI)，半固體培養(yǎng)基分裝量為管高的1／3為宜。2．三角瓶的分裝圖8-2培養(yǎng)基的分裝用于振蕩培養(yǎng)微生物時，可在250m1三角瓶中加入50m1的液體培養(yǎng)基；若用于制作平板培養(yǎng)基用時，可在250m1三角瓶中加入150ml培養(yǎng)基，然后再加入3g瓊脂粉(按

8、2％計算)，滅菌時瓶中瓊脂粉同時被融化。（四）棉塞的制作及試管、三角瓶的包扎為了培養(yǎng)好氣性微生物，需提供優(yōu)良通氣條件，同時為防止雜菌污染，則必須對通入試管或三角瓶內(nèi)空氣預(yù)先進(jìn)行過濾除菌。通常方法是在試管及三角瓶口加上棉花塞等。1．試管棉塞的制作制棉塞時，應(yīng)選用大小、厚薄適中的普通棉花一塊，