松材線蟲、松墨天牛和松樹間的共生關(guān)系研究-研究生課程論

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1、得分：_______南京林業(yè)大學(xué)研究生課程論文2015～20016學(xué)年第二學(xué)期課程號(hào)：課程名稱：論文題目：學(xué)科專業(yè)：森林保護(hù)學(xué)號(hào)：3150462姓名：王立超任課教師：黃麟二○一六年六月內(nèi)容本文研究松材線蟲、松墨天牛和真菌在松樹中的共生關(guān)系實(shí)驗(yàn)材料和方法：（1）真菌小長(zhǎng)喙霉在PDA平板上、25℃條件下培養(yǎng)一周，使用前在5℃條件下保存?；移咸焰咴?0mL的大麥籽粒上培養(yǎng)。（2）線蟲強(qiáng)毒蟲株松材線蟲T-4在25℃條件下在灰葡萄孢上培養(yǎng)，使用前在5℃條件下保存。松材線蟲懸濁液包括成蟲和幼蟲，懸濁液濃度為50000條/mL。（3）昆蟲松墨天牛在恒定條件下培養(yǎng)（25℃，16h光照

2、、8h黑暗），讓其繁殖10代，第七代到第十代成蟲用來(lái)在赤松小苗上產(chǎn)卵，收集天牛所產(chǎn)的卵并將其放置在濕紙巾上，在一天之內(nèi)孵化的幼蟲用于實(shí)驗(yàn)。（4）松枝2014年六月采伐兩顆12年生（胸徑分別為3.9和5.2cm）的赤松和兩顆12年生的黑松（胸徑分別為8.1和9.0cm），分別在實(shí)驗(yàn)1和實(shí)驗(yàn)3中使用。2015年二月采伐3顆12年生的赤松用于實(shí)驗(yàn)2，胸徑分別為7.4、7.6和8.4cm，2014年十月采伐一顆12年生的赤松用于實(shí)驗(yàn)4，其胸徑為6.8cm。樹枝截為15cm一段，在樹枝的兩端用石蠟密封起來(lái)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組樹枝的樹木特定的每組樹枝之間不存在顯著差異(5)接種使用鑿子和

3、鑷子在離樹端13.7mm處從木質(zhì)部分離樹皮（面積22.3mm×17.3mm），用刻刀在漏出的木質(zhì)部中間挖一個(gè)直徑6-7mm圓形刻槽用以放置松墨天牛幼蟲，一份帶有灰葡萄孢或則沒有灰葡萄孢的面積為5×5mm的PDA培養(yǎng)基放置在遠(yuǎn)離樹端、接近圓形刻槽的位置。用到劃長(zhǎng)16.8mm、最大寬度為14.3mm的三角形裂口，在漏出的韌皮部接種20uL的線蟲懸濁液（1000條線蟲）或者是無(wú)菌純凈水。兩個(gè)樹皮傷口最小距離平均為13.7mm，兩個(gè)傷口接種后覆蓋原來(lái)的樹皮，用封口膜包起來(lái)，即使不接種松墨天牛幼蟲，也挖一個(gè)小刻槽，實(shí)驗(yàn)4中松樹枝條不用接種松材線蟲懸液或水，不會(huì)在樹皮上形成傾斜傷

4、口。實(shí)驗(yàn)一、為了確定松墨天牛幼蟲和小長(zhǎng)喙霉對(duì)松材線蟲種群生長(zhǎng)的影響，一組赤松枝條接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長(zhǎng)霉。第二組枝條接種松材線蟲、松墨天牛和PDA，第三組枝條接種松材線蟲和小喙長(zhǎng)霉，第四組枝條接種松材線蟲和PDA。他們被垂直放置使線蟲遠(yuǎn)離容器底部。25℃，16h光照、8h黑暗，相對(duì)濕度100%條件下常溫培養(yǎng)，用純凈水保持濕度。接種18天后，從松枝上剝離樹皮，從枝條上取幼蟲和幼蟲糞便，記錄韌皮部和木質(zhì)部上藍(lán)變面積確定小喙長(zhǎng)霉的繁殖情況，從縱向韌皮部上剝離四份之一到二分之一的樹皮，將樹皮外層剝離，收集里面樹皮以獲得韌皮部樣品，再將里層樹皮的韌皮部剪切為1-2mm大

5、小的樹皮塊，使用一把15mm寬的刀片，從接種松墨天牛幼苗和松材線蟲的地方包括髓取木質(zhì)部樣品，記錄木質(zhì)部樣品真菌繁殖情況，糞便、韌皮部和木質(zhì)部分別在25℃下使用貝爾曼漏斗法分離48-72h，計(jì)算分離線蟲濃度，材料在60℃下烘5-12d，稱重，線蟲密度表示每克材料干重中松材線蟲的數(shù)量。分別使用電子天平和游標(biāo)卡尺測(cè)量幼蟲體重和頭殼寬度，分別精確到0.1mg和0.05mm，根據(jù)頭殼寬度確定幼蟲齡期：0.585–1.170,1.260–1.935,1.980–3.150和3.150–4.365mm分別為一齡、二齡、三齡和四齡蟲。實(shí)驗(yàn)二、確定赤松中韌皮部、木質(zhì)部和天牛幼蟲蛀屑線蟲

6、密度的不同，在2015年2月26日將剛孵化的幼蟲、1000條松材線蟲和一份接有小長(zhǎng)喙霉的PDA接種在10條直徑相似的上述赤松枝條上，2015年3月26日分別將韌皮部、木質(zhì)部和幼蟲蛀屑用以分離線蟲，確定線蟲密度，實(shí)驗(yàn)三、確定松材線蟲種群和小喙長(zhǎng)霉對(duì)松墨天牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響，四組黑松枝條接種松材線蟲、松墨天牛和小喙長(zhǎng)霉三個(gè)物種組成的四種組合。方法和實(shí)驗(yàn)一方法相同，培養(yǎng)條件相同。每天觀察松枝，記錄松墨天牛羽化情況，分性別記錄成蟲數(shù)量，體重和鞘翅長(zhǎng)分別精確到0.1mg和0.05mm。沒有松墨天牛出現(xiàn)的松枝在接種153-164d后分離，稱量幼蟲的鮮重和記錄頭寬、顏色、腸內(nèi)排泄物的

7、有無(wú)以及幼蟲所在的位置。實(shí)驗(yàn)四、為確定松墨天牛幼蟲對(duì)小喙長(zhǎng)霉繁殖的影響，6個(gè)赤松枝條接種小喙長(zhǎng)霉和松墨天牛幼蟲，接種22d后，剝離松枝樹皮，幼蟲蛀屑和幼蟲取樣，測(cè)量幼蟲體重和頭殼寬度文章結(jié)構(gòu)摘要關(guān)鍵詞前言材料與方法真菌線蟲傳播媒介松樹枝條接種方法實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)四數(shù)據(jù)分析結(jié)果赤松枝條中松墨天牛幼蟲和小喙長(zhǎng)霉菌對(duì)松材線蟲種群的影響（實(shí)驗(yàn)一）松墨天牛幼蟲的糞便中高密度松材線蟲的再現(xiàn)（實(shí)驗(yàn)二）黑松枝條中松材線蟲和小喙長(zhǎng)霉菌對(duì)松墨天牛生長(zhǎng)發(fā)育的影響（實(shí)驗(yàn)三）赤松枝條中松墨天牛幼蟲對(duì)小喙長(zhǎng)霉菌的影響（實(shí)驗(yàn)四）討論參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)思路實(shí)驗(yàn)一為研究赤松枝條中松墨