三氧化二砷對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系u266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究論文

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1、三氧化二砷對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究論文【摘要】本研究探討三氧化二砷（As2O3）在體外對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制。用MTT法觀察As2O3對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞術(shù)、DNA凝膠電泳法分析As2O3對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響，以RTPCR法檢測(cè)2μmol/LAs2O3不同處理時(shí)間對(duì)U266細(xì)胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白催化亞單位（hTERT）mRNA的表達(dá)變化，用yelomaCellLineU266AbstractTheaimofthisstudyechanismsunderlyingeffectofarsenictrio

2、xide(As2O3)onmyelomacelllineU266invitro.TheviabilityandapoptosisofU266cellsetryandDNAagarosegelelectrophoresis.TheexpressionofhTERTmRNAol/L.Aftertreatmentol/LAs2O3at24,48and72hours,adoseandtimedependentapoptosisofU266cellscouldbeobserved.AftertreatingU266cellsol/LAs2O3atdifferenttimep

3、oints,atimedependentreductionofprocaspase3,hTERTmRNAandproteinitochondrialtransmembranepotential,initiatingthemitochondialapoptosispathyeloma;U266cell;cellsapoptosis;caspase3;hTERT多發(fā)性骨髓瘤（multiplemyeloma,MM）是一種以骨髓中單克隆漿細(xì)胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的漿細(xì)胞腫瘤，多引起廣泛骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高粘滯血癥、腎功能不全等一系列

4、臨床表現(xiàn)。目前，MM仍無(wú)法治愈。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，三氧化二砷（As2O3）在復(fù)發(fā)和難治性MM的治療中取得了可喜的療效。相關(guān)基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，As2O3在體外通過(guò)使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)，下調(diào)癌基因cmyc的表達(dá)以及影響?zhàn)じ椒肿颖磉_(dá)等多種機(jī)制影響骨髓瘤細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)其凋亡并影響其歸巢。但是，As2O3對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全清楚［1-6］。因此，我們以骨髓瘤細(xì)胞株U266為體外模型，探討As2O3對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。材料和方法材料和試劑As2O3為黑龍江伊達(dá)藥業(yè)公司產(chǎn)品，用注射用水稀釋至1×103

5、μmol/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit購(gòu)自美國(guó)Biovision公司。實(shí)驗(yàn)中使用的單克隆抗體及二抗均購(gòu)自SantaCruzBiotechnology公司。骨髓瘤細(xì)胞株U266由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng)。U266細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。As2O3對(duì)U266細(xì)胞生長(zhǎng)影響的MTT法檢測(cè)將不同濃度As2O3處理48小時(shí)及一定濃度的As2O

6、3處理不同時(shí)間后的樣本置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)492nm的吸光度，每組設(shè)6個(gè)平行孔，以對(duì)照組（0μmol/L）細(xì)胞增殖率為100％，按下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（％）＝（藥物組OD492/對(duì)照組OD492）×100%細(xì)胞凋亡的DNA凝膠電泳檢測(cè)調(diào)整U266細(xì)胞濃度至2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L，作用0、24、48、72小時(shí)后，將5×105細(xì)胞移入無(wú)菌的1.5mlEppendorf管中，4℃2000r／min離心5分鐘，棄上清。加入20μl溶解緩沖液，用移液管尖混勻細(xì)胞沉淀。加10μlRNA酶A(500U/ml)，輕彈管尖混勻。37℃孵育

7、90分鐘。加10μl蛋白酶K(20mg/ml)，輕彈管尖混勻，50℃孵育過(guò)夜。樣品于20g/L瓊脂糖凝膠，25V，電泳3小時(shí)后，在凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)收集細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液接種于25ml培養(yǎng)瓶，細(xì)胞濃度為2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L和5μmol/L，空白對(duì)照組只含培養(yǎng)液，處理0、24、48、72小時(shí)后，收集處理后細(xì)胞，計(jì)數(shù)，然后按MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作后,立即送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。hT