三氧化二砷抑制U266細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及與血管內(nèi)皮生長因子表達的關(guān)系.doc

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1、三氧化二砷抑制U266細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡及與血管內(nèi)皮生長因子表達的關(guān)系【摘要】目的探討三氧化二砷(As2O3)在體外對骨髓瘤細胞系U266增殖、凋亡的影響及與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達的關(guān)系。方法四唑鹽比色法(MTT)觀察As2O3對U266細胞增殖的影響;缺口末端標記法(TUNEL)分析As2O3對U266細胞凋亡的影響;逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RTPCR)檢測2μmol/LAs2O3不同處理時間后U266細胞VEGFmRNA表達的變化;酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測As2O3不同濃度不同處理時間對U266細胞VEGF蛋白表達的變化。結(jié)果(1)As2

2、O3明顯抑制U266細胞增殖,半數(shù)抑制濃度(IC50)為2μmol/L;(2)As2O3能誘導(dǎo)U266細胞凋亡,呈劑量依賴性;(3)As2O3(2,5,10μmol/L)分別處理72h后細胞培養(yǎng)上清中VEGF量呈劑量依賴性減少;(4)考慮細胞增殖對VEGF分泌的影響,2μmol/LAs2O3處理組的上清VEGF量與對照組的差別無統(tǒng)計學(xué)意義,RTPCR顯示2μmol/LAs2O3處理的U266細胞個體VEGFmRNA的表達無變化。結(jié)論As2O3可以誘導(dǎo)骨髓瘤細胞凋亡,抑制其增殖。As2O3可以通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)凋亡,減少腫瘤負荷,減少VEGF總量,但是不改

3、變細胞個體VEGF的表達?！娟P(guān)鍵詞】砷劑多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡血管內(nèi)皮生長因子類多發(fā)性骨髓瘤(MM)是一種單克隆漿細胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的漿細胞腫瘤,主要侵犯骨髓,也可侵犯髓外組織,常引起廣泛骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高黏滯血癥及腎功能不全等一系列臨床表現(xiàn)。目前,MM仍無法治愈。近幾年來,國內(nèi)外研究報道As2O3在復(fù)發(fā)和難治性MM的治療中取得可喜療效[1]?；A(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）通過多種途徑、多樣化機制參與MM的病理形成及臨床特征的產(chǎn)生[2]。筆者以骨髓瘤細胞株U266為體外模型,探討As2O3對骨髓瘤細胞作用

4、后表達的變化,分析兩者關(guān)系。1材料和方法1.1材料1.1.1細胞株骨髓瘤細胞株U266由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈。1.1.2主要試劑As2O3(黑龍江伊達藥業(yè)公司)用注射用水稀釋至1×103μmol/L(儲存液),原位細胞凋亡檢測試劑盒、RTPCR試劑盒(美國Promega公司),Trizol試劑(美國Invitrogene公司),人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(美國Pierce公司),RPMI1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)。1.2方法41.2.1細胞培養(yǎng)U266細胞培養(yǎng)于含10％胎牛

5、血清的RPMI1640液,在37℃、體積分數(shù)為0.05的CO2飽和濕度條件下的孵箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。1.2.2MTT法檢測As2O3對U266細胞增殖的影響將不同濃度As2O3處理48h及半數(shù)抑制濃度(IC50)的As2O3處理不同時間后的樣本置于酶標儀,檢測光密度[D(492nm)],每組設(shè)6個平行孔,以對照組(0μmol/L)細胞增殖率為100％,按公式計算細胞增殖率:細胞增殖率(%)＝[藥物組D(492nm)/對照組D(492nm)]×100%1.2.3TUNEL法檢測原位細胞凋亡收集0,2,5,10μmol/LAs2O3處理36h后的細

6、胞,涂片后用新鮮配置的4g/L多聚甲醛固定,0.2%Triton○RX100室溫滲透5min,沖洗后加入TdT反應(yīng)液,37℃溫盒孵育60min,1×SSC枸櫞酸鈉緩沖液浸泡15min終止反應(yīng),加入1∶500辣根過氧化物酶100μL,室溫反應(yīng)30min,加入DAB混合液,出現(xiàn)淡棕色背景后沖洗,高倍鏡下觀察,DAB顯色后凋亡細胞呈棕褐色。1.2.4RTPCR檢測VEGF基因表達收集2μmol/LAs2O3不同處理時間組細胞,提取總RNA,按照試劑盒說明書合成cDNA。VEGF基因擴增引物及內(nèi)參βactin由上海生工生物工程有限公司合成。VEGF擴增片斷為VE

7、GF121408bp和VEGF165541bp。上游:5/gaagtggtgaagttcatggatgtc3/下游:5/cgatcgttctgtatcagtctttcc3/內(nèi)參βactin基因上游引物:5/cgctgcgctggtcgtcgaca3/下游引物:5/gtcacgcacgatttcccgct3/擴增片斷為619bp。PCR條件,VEGF94℃30s→64℃60s→72℃60s,共32個循環(huán)產(chǎn)物,在20g/L瓊脂糖凝膠上電泳,凝膠成像系統(tǒng)顯示及分析結(jié)果。1.2.5VEGF含量檢測采用ELISA技術(shù),按試劑盒說明書操作,樣品及VEGF

8、標準品均采用復(fù)孔,在酶標儀450nm波