硒-藻藍(lán)蛋白綴合物的制備及抗腫瘤活性研究碩士學(xué)位論文

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1、廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文硒-藻藍(lán)蛋白綴合物的制備及抗腫瘤活性研究姓名：部音利申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：水產(chǎn)品加工及貯藏工程指導(dǎo)教師：馮亞非20090601硒．藻藍(lán)蛋白綴合物的制備及抗腫瘤活性研究摘要背景與目的藻藍(lán)蛋f蘭t(Phycocyanin，PC)存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中，是藻類(lèi)特有的捕光色素蛋白。由于藻藍(lán)蛋白具有對(duì)光能吸收傳遞的特殊性質(zhì)，已被用來(lái)作為腫瘤激光治療的光敏劑。藻藍(lán)蛋白帶有熒光，可制成熒光標(biāo)記物，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷和免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中。近期的研究顯示，藻藍(lán)蛋白還具有一系列重要的生理活性，其中對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用受到關(guān)注，為了提高抗腫瘤活性，

2、富硒藻藍(lán)蛋白的研究也同益活躍。硒是人體必需的微量元素，具有重要的生理功能和廣泛的藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)能夠控制紅色元素硒原子的聚合，形成以蛋白為核心、硒為膜，或者以蛋白質(zhì)為分散劑的硒納米粒子。該粒子粒徑20．60nm，呈紅色，易溶于水，對(duì)熱穩(wěn)定，不會(huì)轉(zhuǎn)化成灰色、黑色元素硒，并且對(duì)小鼠具有抗氧化、抗衰老、增強(qiáng)免疫力、抑制腫瘤等生物活性。藻藍(lán)蛋白雖然具有生物活性，但普遍認(rèn)為不如螺旋藻多糖顯著。為了提高其生物活性，目前的研究多集中于生物富集硒，即在培養(yǎng)螺旋藻的環(huán)境中加入含硒物質(zhì)，使硒在螺旋藻體生長(zhǎng)過(guò)程中被利用并富集于細(xì)胞內(nèi)。此種方法所得到的藻體中各部分均含有硒元素，且較難準(zhǔn)確

3、控制藻藍(lán)蛋白與硒的比例。本實(shí)驗(yàn)采用藻體外綴合的方法，將純化后的藻藍(lán)蛋白與一定比例的硒作用，從而得到硒．藻藍(lán)蛋白綴合物，能夠準(zhǔn)確控制硒在綴合物中的含量，并得到單一的硒．藻藍(lán)蛋白，純度高，操作較為簡(jiǎn)便。藻藍(lán)蛋白和硒都具有抗腫瘤活性，而許多硒．蛋白質(zhì)復(fù)合物也都表現(xiàn)出一定的抑瘤作用。我們有理由假設(shè)硒．藻藍(lán)蛋白綴合物因協(xié)同作用而使其抗腫瘤活性更強(qiáng)、對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的破壞程度更低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)硒．藻藍(lán)蛋白綴合物、藻藍(lán)蛋白的抗腫瘤活性進(jìn)行探究和對(duì)比，期望得到既有較好的抗腫瘤活性，又能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力、最大限度減少對(duì)機(jī)體損害的新型活性物質(zhì)。方法‘1．采用細(xì)胞破碎、鹽溶、鹽析等方法，從螺旋藻中提取

4、藻藍(lán)蛋白粗品，探索高提取率、大規(guī)模提取的實(shí)驗(yàn)條件。2．設(shè)計(jì)雙水相萃取法最佳方案，純化PC。以紫外．可見(jiàn)吸收光譜、等電點(diǎn)聚焦電泳檢沏,Opc的純度。I3．se(Ⅳ)與Pc進(jìn)行綴合作用，并對(duì)所得綴合物se—Pc進(jìn)行表征(主要為紫外．可見(jiàn)吸收光譜和紅外吸收光譜)，并與單純PC進(jìn)行比較。4．KM小鼠隨機(jī)分組，檢驗(yàn)PC、Se．PC對(duì)荷瘤小鼠的腫瘤抑制作用。5．以CY為陽(yáng)性對(duì)照組，考察PC、Se．PC各劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)變化，對(duì)小鼠免疫系統(tǒng)的影響。結(jié)果1．ATPE法純化PC最佳條件如下：PEG．4000(w／w)15％，KPi(w／w)16％(K2HP04與KH2P04質(zhì)量

5、比為35：65)，pH=6．28，PC粗提液(w／w)10％。PC粗品經(jīng)此ATPE體系純化3次純度可達(dá)3．83，回收率23．99％。經(jīng)超濾后純度可達(dá)到4．04。2．純化后的藻藍(lán)蛋白測(cè)定紫外可見(jiàn)吸收光譜，在278nm、360nm矛11620nm處有特征吸收峰，等電點(diǎn)聚焦電泳測(cè)得等電點(diǎn)為4．3。主要技術(shù)指標(biāo)與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明PC提取純化技術(shù)成熟，結(jié)果穩(wěn)定。3．Se．PC與PC的紫外．可見(jiàn)吸收光譜相比較，620nm處的特征吸收下降，下降幅度與作用時(shí)間、Se([V)$11PC的摩爾比正相關(guān)；278nnl和384nm處的吸收則隨Se(IV)和PC摩爾比的增加和作用時(shí)

6、問(wèn)的延長(zhǎng)而增大。紅外光譜圖中，PC的酰胺I帶為1653．2cm～，為c【螺旋，而Se．PC綴合物的酰胺I帶為1647．Ocm～，屬無(wú)規(guī)則卷曲。4．PC50mg／l(g／d、75mg／kg／d、100mg／kg／d給藥組，抑瘤率分別為25．O％、293％、41．2％；Se—PC50mg／kg／d、75mg／kg／d、100mg／kg／d給藥組，抑瘤率分別為33．6％、37．9％、40．8％。且PC、Se．PC各劑量組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均有所增加。結(jié)論1．與傳統(tǒng)柱層析法相比，雙水相萃取法純化PC的優(yōu)勢(shì)明顯。ATPE法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，每次處理樣品量大，能夠最大限度地保留P

7、C的活性，適合較大體積PC粗提液的純化工作。2．綴合物在278nnl處吸光值的增加說(shuō)明，隨著綴合作用的進(jìn)行，PC的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，使原來(lái)位于分子結(jié)構(gòu)內(nèi)部的酪氨酸和色氨酸暴露于分子表面。3．PC、Se．PC均具有一定的抗腫瘤活性，且抑瘤率均與給藥量正相關(guān)，最佳抑瘤效果均出現(xiàn)在100m眺g給藥組，PC組為41．2％，Se．PC組為40．8％。4．PC、Se．PC對(duì)小鼠免疫器官胸腺、脾臟均有一定的保護(hù)促進(jìn)作用。與CY相比，雖然PC、Se．PC中低劑量組腫瘤抑制率偏低，但卻有效地保護(hù)了機(jī)體免疫器官，此外，高劑量組對(duì)腫瘤