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《endostatin抑制人卵巢癌細胞生長及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用 》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、Endostatin抑制人卵巢癌細胞生長及其在裸鼠皮下移植瘤中的作用劉梅梅，隋麗華，李佩玲，程麗【關(guān)鍵詞】抑制 【關(guān)鍵詞】卵巢癌；移植瘤；內(nèi)皮抑素；Bcl2/Bax 0引言 我們采用人漿液性乳頭狀囊腺癌SKOV3細胞系及其荷瘤鼠為研究對象，研究Endostatin對其增殖、凋亡的影響及作用機制，為其應(yīng)用于卵巢癌的臨床治療提供試驗依據(jù). 1材料和方法 1.1材料 選用雌性6~8周齡BALB/c裸鼠10只，SPF條件下飼養(yǎng).人漿液性乳頭狀囊腺癌細胞系SKOV3由北京醫(yī)科大學(xué)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科饋贈，用RPMI1
2、640（含10g/L小牛血清）培養(yǎng)基于37℃,50mL/LCO2條件下培養(yǎng).Endostatin購自煙臺麥得津生物工程公司，置于4℃保存.抗Bcl2，抗BaxmAb及SP試劑盒購自北京中衫試劑公司. 1.2方法 1.2.1MTT法測定SKOV3細胞生長抑制率分組：PBS對照組（10mmol/LPBS）和實驗組（0.1，1.0，5.0，10.0和15.0mg/LEndostatin）.SKOV3細胞以5×107/L密度接種于96孔板，每組設(shè)定6個平行孔，并設(shè)定空白對照.細胞貼壁培養(yǎng)24h后，分別加入上述不同濃度
3、的藥物，作用48h后測定細胞A490值.計算Endostatin對卵巢癌細胞SKOV3生長的影響和抑制情況.抑制率=（PBS對照組A490-藥物組A490）/PBS對照組A490×100%. 1.2.2透射電鏡下觀察SKOV3細胞凋亡實驗組SKOV3細胞作用不同時間（24，48和72h）后，消化離心，用4℃，0.25g/L戊二醛固定，0.1g/L鋨酸后固定，系列乙醇丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包埋，制成超薄切片，透射電鏡下觀察細胞凋亡形態(tài). 1.2.3免疫細胞化學(xué)檢測凋亡調(diào)控相關(guān)蛋白質(zhì)表達的變化實驗組SKOV3細胞爬片
4、培養(yǎng)作用不同時間（24，48和72h）后，丙酮室溫固定10min，進行免疫細胞化學(xué)SP法染色.按說明書操作，DAB顯色.結(jié)果判定：以細胞核和細胞質(zhì)呈明確的棕黃色為陽性染色. 1.2.4Endostatin對裸鼠腫瘤生長的影響 1.2.4.1裸鼠皮下瘤模型的建立已培養(yǎng)的SKOV3細胞，使細胞濃度達到5×1010/L，從裸鼠右肩胛部近腋窩處進針，每只裸鼠注射一點，約1×107個細胞.觀察接種部位有無滲出、腫瘤生長及裸鼠狀況，待皮下瘤體積約100mm×100mm×100mm時分組實驗. 1.2.4.2Endost
5、atin對卵巢腫瘤的治療作用將裸鼠隨機分成治療組和對照組，每組5只.實驗組裸鼠每日皮下注射Endostatin20mg/kg，注射部位遠離腫瘤形成部位，對照組以同樣方法每日注射PBS.每日測量腫瘤長度和寬度，計算腫瘤體積.治療21d后將裸鼠處死，剝離出皮下腫瘤，備用. 1.2.5Endostatin對腫瘤組織中細胞凋亡的影響將切下的瘤組織置于0.25g/L戊二醛中，4℃固定，電鏡觀察瘤組織中細胞形態(tài)的改變和觀察細胞是否出現(xiàn)凋亡小體. 1.2.6Endostatin對瘤組織中Bcl2及Bax蛋白和mRNA表達的
6、影響常規(guī)免疫組織化學(xué)法檢測瘤組織中Bcl2及Bax蛋白的表達情況.將切下的瘤組織置于液氮中，采用常規(guī)RTPCR方法觀察Endostatin對Bcl2及BaxmRNA表達的影響.引物由上海生物工程有限公司合成，序列引自文獻〔1〕. 統(tǒng)計學(xué)處理：數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用Studentst檢驗. 2結(jié)果 2.1Endostatin對SKOV3細胞生長的抑制作用不同濃度的Endostatin處理SKOV3細胞48h后，與對照組相比，SKOV3的生長均受到不同程度的抑制.比較A490值結(jié)果顯示，細胞PBS對照組、0.
7、1，1.0和5.0mg/LEndostatin組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），而10.0和15.0mg/LEndostatin組的A490值分別與前4組比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.01）. 2.2Endostatin對SKOV3細胞凋亡的影響在透射電鏡下觀察，Endostatin處理SKOV3后，可見細胞皺縮，胞核固縮，細胞質(zhì)內(nèi)可見線粒體嵴絮狀變，出現(xiàn)凋亡細胞，隨Endostatin作用時間延長和劑量的增加，上述變化越來越明顯(圖1). 2.3Endostatin對SKOV3細胞凋亡調(diào)控相關(guān)
8、蛋白表達的影響SKOV3細胞中Bcl2和Bax蛋白表達均定位于胞質(zhì)和胞核.與對照組相比，Endostatin處理后的SKOV3細胞中，Bcl2和Bax蛋白表達未見明顯增強和減弱，并且在Endostatin作用時間和劑量上亦無明顯相關(guān)性. 2.4Endostatin對裸鼠皮下移植SKOV3腫瘤生長的影響Endostatin治療組腫瘤生長緩慢，治療15d后，腫瘤體積明顯小于
