cd59sirna對人卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用

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1、CD59siRNA對人卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的作用【關(guān)鍵詞】抗原,CD59;卵巢腫瘤;RNA干擾;小鼠，裸[ABSTRACT]ObjectiveToinvestigatetheinhibitioneffectofCD59siRNAonCD59geneandthegroice.MethodsA2780cellsid(groupT)andblankplasmid(groupV),respectively,usingLipofectamne2000.ThesecellsandA2780cellsice.TheinhibitioneffectofCD59siRNAontum

2、orandtheexpreesionofCD59orgromunohistochemistry(IHC).ResultsparedorvolumeandRNAandCD59alsodecreased(F=817.77,247.71;q=26.59-52.25;P<0.05).ConclusionCD59siRNAcansignificantlysuppresstheexpressionofCD59andgros;RNAinterference;mice,nude　　CD59是一種廣泛分布于組織細(xì)胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨固糖蛋白，具有多種重要的免疫功能,

3、其最重要的功能是作為補(bǔ)體系統(tǒng)終末階段的調(diào)節(jié)蛋白，以同源限制的方式抑制補(bǔ)體攻膜復(fù)合物(MAC)的裝配以保護(hù)宿主細(xì)胞免受補(bǔ)體溶解破壞[13]。近年來，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道，多種實體腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)CD59等一系列膜補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白(mCRPs)，使腫瘤細(xì)胞逃脫了自身的免疫監(jiān)視[4]，與腫瘤的失控性生長和惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[5]，同時也是導(dǎo)致眾多腫瘤治療失敗的重要原因。本課題組前期利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)構(gòu)建了針對CD59的pSUPERCD59siRNA重組載體[67]，并在體外實驗證明了其對CD59的沉默效應(yīng)。為深入了解CD59基因表達(dá)變化對腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)生長的影響，

4、本研究利用該重組載體，觀察其在荷瘤裸鼠體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞CD59基因的沉默及抑瘤效應(yīng)，為腫瘤基因治療提供動物實驗依據(jù)?！　?材料和方法　　1.1材料　　人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780細(xì)胞由本實驗室保存;小鼠抗人CD59抗體購自BDPharmingen公司;Lipofectamne2000和總RNA提取試劑盒均購自Invitrogen公司;4～6周齡雌性裸鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司;pSUPER質(zhì)粒由我院羅兵教授惠贈;重組質(zhì)粒pSUPERCD59siRNA由本室構(gòu)建和保存;AccessRTPCRA1250試劑盒購自Promega公司;DAB顯色試劑盒購自北京中杉金

5、橋公司;SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。　　1.2方法　　1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞克隆的篩選用　2.5g/L胰酶消化生長狀態(tài)良好的A2780細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度達(dá)2×108/L,取0.5mL加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。利用脂質(zhì)體Lipofectamne2000，將pSUPERCD59siRNA及空質(zhì)粒pSUPER分別轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞。G418選擇性培養(yǎng)基中篩選具有抗性的單細(xì)胞的細(xì)胞克隆,擴(kuò)大培養(yǎng)。將篩選出的干擾質(zhì)粒整合的細(xì)胞克隆作為干擾組(T組)，空質(zhì)粒整合的細(xì)胞克隆為陰性對照組(V組)，未轉(zhuǎn)染

6、的A2780細(xì)胞為空白對照組(C組)?！　?.2.2移植瘤裸鼠模型的建立4～6周齡雌性裸鼠飼養(yǎng)在SPF環(huán)境中,隨機(jī)分為3組(T組、V組和C組)，每組6只。采用常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞種植法，收集處于對數(shù)生長期的各組A2780細(xì)胞，于相應(yīng)組每只裸鼠右腋皮下注射細(xì)胞5×106個(0.2mL)。連續(xù)觀察30d，記錄腫瘤出現(xiàn)的時間;并于接種后每5d測量腫瘤的長軸(L)和短軸(S1.5[9]統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以±s表示，組間比較采用方差分析?！　?結(jié)果　　2.1裸鼠移植瘤生長曲線　　皮下注射卵巢癌A2780細(xì)胞6～8d后，V組和C組的裸鼠均可觀察到4～6mm大小皮下腫瘤結(jié)節(jié)，并隨時

7、間的延長不斷增大;而T組在接種后12～15d才可觀察到腫瘤結(jié)節(jié)，并且生長緩慢。18只裸鼠無死亡，所有腫瘤包塊均無紅腫和潰破。裸鼠腫瘤生長曲線(圖1)顯示，與V組和C組相比，T組腫瘤的生長明顯受到抑制。接種后第30天,與V組和C組比較，T組腫瘤體積和質(zhì)量明顯減小(F=301.88、5.39,q=4.01～30.41,P<0.05);V組與C組的腫瘤體積和質(zhì)量比較，差異無顯著意義(q=0.75、0.02,P>0.05),見表1。表1各組裸鼠移植瘤的質(zhì)量和體積　　2.2各組裸鼠移植瘤CD59mRNA表達(dá)比較　　各組裸鼠腫瘤組織中CD