園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

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1、第九章園藝植物遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建主要內(nèi)容根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)載體的構(gòu)建發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體的構(gòu)建載體構(gòu)建中常用的選擇標記基因和報告基的因園藝植物常用的遺傳轉(zhuǎn)化載體類型目的基因與載體的連接根癌農(nóng)桿菌一般只侵染雙子葉植物。農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）有2種重要植物病原菌根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumerfaciens)攜帶有Ti質(zhì)粒（Tumor-inducingplasmid）發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacteriumrhizogenesis）攜帶有Ri質(zhì)粒(Root-inducingplasmid)在植物

2、基因轉(zhuǎn)化的研究中，主要使用細菌質(zhì)粒(大腸桿菌質(zhì)粒，農(nóng)桿菌質(zhì)粒)和植物病毒作為載體。其中以根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化載體是最為重要，是本章重點介紹的內(nèi)容。冠癭瘤病(根癌病)癥狀1、植物根及莖基部產(chǎn)生2、最初原因是受傷后引起alfalfa根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumerfaciens）發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogenesis)第一節(jié)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)?；蜣D(zhuǎn)化載體的構(gòu)建Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)歷史1974年zeazen等從根癌農(nóng)桿菌中分離出一巨大質(zhì)粒，稱為致癌質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid）,簡稱Ti質(zhì)

3、粒.最初的發(fā)現(xiàn)和命名是1907年,Smith和Townsent發(fā)現(xiàn)雙子葉植物常發(fā)生的冠癭瘤是由根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)誘發(fā)形成的.Ti質(zhì)粒的遺傳特性及類型Ti質(zhì)粒為染色體外遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，其分子量為9.5×107～1.6×108，大小為180～250kb。迄今人們已從多種植物中分離出了不同種類的農(nóng)桿菌，它們的Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)特性均有差別。根據(jù)Ti質(zhì)粒誘導合成的冠癭堿(opine)種類不同，Ti質(zhì)?？杀环譃樗姆N類型：章魚堿型(octopine)、胭脂堿型(nopaline)、農(nóng)桿

4、堿型(agropine)、農(nóng)桿菌素堿型(agrocinopine)或稱琥珀堿型(succinamopine)。其中，章魚堿型和胭脂堿型Ti質(zhì)粒較為常見。Ti質(zhì)粒的基因位點及其功能區(qū)域Ti質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖（左）及乙酰丁香酮及其衍生物的結(jié)構(gòu)示意圖（右）（1）T-DNA區(qū)（transferred-DNAregions）:T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上脫離下來轉(zhuǎn)移并整合到植物的核基因組上的一段DNA。T-DNA片段上的基因與腫瘤形成有關(guān)。（2）Vir區(qū)（virulenceregion）:該區(qū)段上的基因的產(chǎn)物為T-DNA的轉(zhuǎn)移及整合

5、所必需，它導致農(nóng)桿菌產(chǎn)生毒性，故稱之為毒區(qū)。在Vir區(qū)有VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG、VirH7個操縱子共24個基因。（3）Con區(qū)（regionsencodingconjugations）:該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因（tra）,調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，故稱為結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（originofreplication）:該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱為復(fù)制起始區(qū)（點）。LBRBTi質(zhì)粒介導基因轉(zhuǎn)化的原理1.植物受傷后會在傷口

6、分泌出一些酚類物質(zhì)(如乙酰丁香酮、α-羥基乙酰丁香酮等)。2.酚類物質(zhì)誘導Ti質(zhì)粒上毒性基因(vir)表達:當根癌農(nóng)桿菌接觸到植物表面的受傷部位后，這些酚類小分子化合物誘導信號經(jīng)VIRA蛋白傳遞給VIRG，VIRG激活其它vir基因(virB、virC、virD、virE)表達Ti質(zhì)粒上毒性基因(vir)表達。3.T-DNA單鏈分子釋放：virD基因編碼一種核酸內(nèi)切酶，先在T-DNA右邊緣區(qū)(RB)切開一個單鏈缺口，再在同一鏈左邊緣區(qū)(LB)切開另一個單鏈缺口，使T-DNA以單鏈形式釋放出來。4.T-DNA單鏈分子轉(zhuǎn)移到寄主細胞：T-D

7、NA單鏈分子與vir產(chǎn)物VIRD2蛋白共價結(jié)合，并在VIRD4和VIRB蛋白的幫助引導下穿過根癌農(nóng)桿菌的內(nèi)膜、外膜、細胞壁、以及植物的細胞壁、細胞膜和核膜。Ti質(zhì)粒介導基因轉(zhuǎn)化的原理5.T-DNA整合到植物細胞的染色體中。T-DNA單鏈分子進入植物細胞后，在植物有關(guān)酶體系的催化下，互補的雙鏈T-DNA分子,在RB序列的引導下，T-DNA分子整合到植物細胞的染色體中。6.T-DNA區(qū)域中的生長素和細胞分裂素基因過量表達導致細胞大量增值，形成冠癭瘤，隨著轉(zhuǎn)化細胞的增值，T-DNA也被大量擴增，冠癭堿合成基因的拷貝也隨之增加，這些基因表達后催

8、化合成冠癭堿，為農(nóng)桿菌的生長提供碳源和氮源。信號受體（VIRA）酚類物質(zhì)誘導信號VIRGRBLB轉(zhuǎn)移到寄主細胞整合到植物染色體中T-DNA單鏈分子釋放VIRG激活virB、virC、virD、virE、vi