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1、蜱鐵蛋白基因在大腸桿菌中的克隆和表達(dá)分析系別：生物工程班級(jí)：06-4組別：D組組員：廣慧娟學(xué)號(hào)：06031405關(guān)程程學(xué)號(hào)：06031404尹曉歡學(xué)號(hào)：06031427孫恒一學(xué)號(hào)：06031417劉博學(xué)號(hào)：06031413指導(dǎo)教師：劉寶全完成日期：2009-6-29目錄一、概述1二、蜱鐵蛋白DNA、MRNA、氨基酸序列的獲取21、蜱鐵蛋白DNA22、蜱鐵蛋白mRNA序列23、蜱鐵蛋白氨基酸序列3三、蜱鐵蛋白相關(guān)信息（網(wǎng)站、文獻(xiàn)查閱）3四、材料和方法41、材料41.1蜱的飼養(yǎng)及試驗(yàn)動(dòng)物41.2質(zhì)粒和宿主菌株42、方法
2、52.1蜱總RNA的分離及cDNA的合成52.2引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增目的基因72.3目的基因的克隆和測序82.4鐵蛋白基因的原核表達(dá)及親合純化102.5WesternBlot方法檢測微小牛蜱鐵蛋白（文獻(xiàn)查閱）12五、相關(guān)說明：131、表達(dá)載體的選擇132、克隆載體與表達(dá)載體的區(qū)別133、如何提高外源基因片段在原核細(xì)胞中的表達(dá)量13參考資料13一、概述蜱是一類以吸血為生的節(jié)肢動(dòng)物，蜱類不僅在人、畜體上刺吸血液，造成宿主的血液損失，而且引起皮膚奇癢，傷口發(fā)炎、水腫等多種反應(yīng)。更重要的是，作為人和動(dòng)物的許多病原的傳播媒介
3、，包括細(xì)菌、真菌、病毒、立克次體、螺旋體和寄生原蟲等多種病原。微小牛蜱也是獸醫(yī)上常見的體外寄生蟲,是傳播牛疾病最多的一種蜱,可傳播牛巴貝斯蟲病、牛雙芽巴貝斯蟲病和牛邊緣邊蟲病。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)統(tǒng)計(jì)，世界上有80%的牛被侵襲，僅硬蜱給畜牧業(yè)造成的損失，全球每年就高達(dá)70億美元。長期以來，藥物滅蜱一直是蜱及蜱傳播疾病的主要控制手段，由于蜱抗藥性出現(xiàn)、食品安全和環(huán)境污染等問題,目前的藥物控制已顯現(xiàn)出它嚴(yán)重的局限性,迫切需要尋找新的防制策略。1995年研制出微小牛蜱的腸抗原Bm86的重組疫苗，它的成功使人們確信，
4、免疫控制是目前最有希望的方法之一。但該疫苗不足之處也十分明顯，該疫苗的局限性激勵(lì)有關(guān)學(xué)者尋找其他分子。生物技術(shù)和信息技術(shù)的快速發(fā)展為蜱的功能分子的研究提供了有力的手段。從現(xiàn)有的研究看，蜱體內(nèi)具有多種疫苗侯選價(jià)值的分子，例如，蜱鐵蛋白、抗凝血分子。、免疫調(diào)節(jié)分子等。蜱功能分子的具有良好的開發(fā)前景：1、作為抗蜱疫苗的應(yīng)用，現(xiàn)在從蜱體分離出的許多抗原分子例如微小牛蟀Bm86以及本實(shí)驗(yàn)分離的半胱氨酸蛋白鐵蛋白具有一定的免疫保護(hù)作用。2、抗病原傳播疫苗的應(yīng)用。蜱的危害不僅是作為寄生蟲，更重要的作為傳播病原的媒介。如果能夠用從
5、蜱體分離出的特定病原的抗原對(duì)宿主進(jìn)行免疫，使蜱叮咬宿主后，降低或使蜱喪失媒介能力，則能達(dá)到阻斷病原的傳播。3、尋找抗藥性對(duì)策。蜱抗藥性問題一直是藥物滅蜂的一個(gè)突出問題，且大量化學(xué)藥物的使用容易造成環(huán)境污染和食品污染。研究表明，蜱體內(nèi)一些酶分子是與抗藥性產(chǎn)生相關(guān)的，因此，這些分子的研究有助于尋找抗藥性對(duì)策。鐵是一種重要的營養(yǎng)元素，但它的富集能致毒。鐵蛋白是普遍存在于生物體內(nèi)的一種保守性較高的多功能多亞基的生物蛋白，其作用是貯存鐵和對(duì)生物體內(nèi)鐵含量進(jìn)行調(diào)控，因此在生物體內(nèi)鐵含量過多時(shí)起到解毒的作用。1蜱是以吸血為生的寄
6、生蟲，宿主紅細(xì)胞中含有大量的鐵，據(jù)研究，蜱是利用鐵蛋白及其相關(guān)蛋白功能來處理大量的鐵以消除對(duì)自身的毒性。因此鐵蛋白是蜱體內(nèi)一種十分重要的功能分子，為了進(jìn)行抗蜱疫苗的研制，本研究對(duì)微小牛蜱鐵蛋白編碼基因進(jìn)行克隆、測序、表達(dá)和分析。二、蜱鐵蛋白DNA、mRNA、氨基酸序列的獲取1、蜱鐵蛋白DNA1GTTTTGCTTCAACAGTGATTGAACGAGCATCGCCAAACGTGCTCTCTCTCTCTTCCGATC61CTTTCTCGCTAAATTAATCTTGAAGTACAGTTTGAGATCCCGTCCGCCAAG
7、CAGCCGAAG121AAGATGGCCGCAACTCAGCCCCGTCAGAACTACCATGTCGATTGCGAAGCCCGCATCAAC181AAGCAGATCAACTTGGAACTCTACGCGAGCTACGTCTACACATCAATGGCCTACTACTTC241GATCGCGATGATGTGGCACTGCCGGGATTCCACAAGTTCTTCAAGAAGAGCAGCGATGAG301GAGCGTGAGCATGCCCAGAAGCTGATGAAGTATCAAAACATGCGCGGAGGGCGCGTGGT
8、G361CTGCAGGCGATACAGAAGCCATCGCGGGACGAATGGGGCGCAGGCTTGGACGCCATGCAG421GCTGCACTTGAGCTGGAGAAGACTGTCAACCAGTCACTGCTGGACTTGCACAAGCTGGCA481AACGATCATAATAACGCTCAGCTGTGCGACTTCCTGGAAAGCGAGTACCT
