降解纖維素菌種篩選與纖維素降解分析

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1、-------國內(nèi)圖書分類號：Q933國際圖書分類號：579.25工學(xué)博士學(xué)位論文降解纖維素菌種篩選及纖維素降解研究博士研究生：白洪志導(dǎo)師：楊謙教授申請學(xué)位：工學(xué)博士學(xué)科、專業(yè)：環(huán)境科學(xué)與工程 所在單位：生命科學(xué)與工程系答辯日期：2008年10月 授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)-----------ClassifiedIndex:Q933 U.D.C:579.25DissertationfortheDoctoralDegreeinEngineeringSCREENINGOFCELLULOSEDEGRADATIONFUNGIANDTHEST

2、UDYOFITSDEGRADATIONCHARACTERISTICSCandidate:BaiHongzhiSupervisor:Prof.YangQianAcademicDegreeAppliedfor:DoctorofEngineering Speciality:EnvironmentalEngineering Affiliation：LifeScienceandEngineeringOct,2008DateofDefence:HarbinInstituteofTechnologyDegree-Conferring-Institut

3、ion:-----------摘要摘要利用纖維素的最佳方法是微生物降解轉(zhuǎn)化，鑒于目前纖維素降解菌株酶活力低、纖維素酶誘導(dǎo)產(chǎn)酶及纖維素降解機(jī)理不完全清楚等限制纖維素資源有效利用的情況下，為了有效利用纖維素這種可再生能源，篩選高效降解菌，研究菌株產(chǎn)酶機(jī)制以及纖維素降解機(jī)理仍然具有重要的理論和實(shí)踐意義。本文從57份土樣中，通過分離純化得到97株菌株。對其進(jìn)行剛果紅鑒別培養(yǎng)基和濾紙條液體培養(yǎng)法初篩，并結(jié)合復(fù)篩得到2株纖維素酶活較高的菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定H-11為簡青霉（Penicilliumsimplicissimum），C-08為綠色木霉（Tr

4、ichodermaviride）。研究了幾種影響二菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的因素，液體發(fā)酵結(jié)果表明：麩皮和稻草為適合碳源，兩者比例H-11為4:3，C-08為5:2；最適有機(jī)氮源為豆餅粉，而無機(jī)氮源分別是KNO3和(NH4)2SO4。H-11產(chǎn)酶最適為豆餅粉，而C-08產(chǎn)酶的(NH4)2SO4:豆餅粉比例為1:5。最適產(chǎn)酶碳源和氮源比例，H-11為7:1，C-08為5:1；最適百分含量，都為3.6%；最適產(chǎn)酶pH，H-11為3.6，C-08為3.2；最適溫度都為30℃；最適產(chǎn)酶時間H-11為144h，C-08為96h。固態(tài)發(fā)酵結(jié)果表明：秸稈粉和麩皮

5、為2∶4最適合產(chǎn)酶；尿素和氨態(tài)氮 適合H-11產(chǎn)酶。氨態(tài)氮適合C-08產(chǎn)CMCase，NO3-利于產(chǎn)Xylanase，其中NH4NO3最好；料水比1∶1比較適合H-11產(chǎn)CMCase，1∶1.5適合產(chǎn)Xylanase。料水比1∶2適合C-08產(chǎn)CMCase，1∶2.5適合產(chǎn)Xylanase；H-11隨底物粒度的降低CMCase增加，在60~100目時產(chǎn)Xylanase最低。稻草粉粒度40~100目時，適合C-08產(chǎn)CMCase，此范圍外適合產(chǎn)Xylanase；初始pH為3和4時則適合H-11菌株產(chǎn)CMCase和Xylanase。pH值為

6、4適合C-08 產(chǎn)酶；孢子接種量為7~8×107孢子/mL時適合兩株菌產(chǎn)酶；28℃適合H-11產(chǎn)酶，在低于28℃時適合C-08產(chǎn)酶；發(fā)酵時間H-11為60h，C-08為72h。 固定化研究表明，制備小球的最適海藻酸鈉溶液濃度為5%。麩皮汁較適 合菌株產(chǎn)酶，H-11比C-08產(chǎn)酶能力強(qiáng)。菌株間親和性不強(qiáng)。H-11則在pH為3 和4時，更適合產(chǎn)CMCase和Xylanase，C-08產(chǎn)酶適宜pH為7。固定化細(xì)胞產(chǎn)酶 能力強(qiáng)于游離細(xì)胞。Tween-80有利于提高菌株的產(chǎn)酶活力。利用液體培養(yǎng)和洗滌菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)法研究了碳源對菌株的誘導(dǎo)特性。結(jié)果發(fā)

7、現(xiàn)D-甘露糖對H-11有較好的誘導(dǎo)作用，葡萄糖對C-08有較好的產(chǎn)酶作用。葡萄糖促使H-11、C-08產(chǎn)生FPase、CMCase、C1和β-Gase，各種酶------------I------------哈爾濱工業(yè)大學(xué)工學(xué)博士學(xué)位論文產(chǎn)量在菌株間及菌株內(nèi)差別很大。制備細(xì)胞外、細(xì)胞壁膜、細(xì)胞內(nèi)纖維素酶，并用其分別轉(zhuǎn)化纖維二糖，對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物高效液相色譜定性分析，從而探討碳源的誘導(dǎo)本質(zhì)。結(jié)果顯示：H-11胞內(nèi)酶和C-08的胞外酶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，除產(chǎn)生葡萄糖外，亦產(chǎn)生一種未知的物質(zhì)A。胞壁膜酶無轉(zhuǎn)化作用。H-11的胞外酶和C-08的胞內(nèi)酶液對纖維

8、二糖除水解外亦有轉(zhuǎn)化作用。從而證明纖維二糖不是菌株的誘導(dǎo)物。將H-11液體發(fā)酵粗酶液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、柱層析后得到電泳純的β-GaseⅠ、β-GaseⅡ和CMCase組分。對純組分的理化性質(zhì)研究表明：三組分