《酶的分離純化》ppt課件

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1、第三章酶的分離純化本章重點各種分離方法的操作原理分離方法的應(yīng)用原則酶分離純化中應(yīng)注意的問題酶制劑的來源3.1酶純化的必要性3.2起始材料的選擇3.3酶的萃取3.4分離方法3.5酶純化步驟的設(shè)計3.6純化步驟的定量評價3.7在純化過程中酶活力的損失3.1酶純化的必要性生物細胞中同時存在多種多樣的酶。酶在生物細胞中的分布并不是均一的。許多酶可能作用于同一個底物。某種酶的純化程度根據(jù)研究目的而定。3.2起始材料的選擇不顧及酶的來源時，可選擇酶含量高的材料。微生物培養(yǎng)物注意材料的年齡注意在生物體內(nèi)的富集區(qū)域3.3酶的萃?。ㄌ幚硪簯?yīng)及時處理，否則在均漿上加一薄層甲苯可以防止微生物感染。

2、）（1）膜和細胞壁的破碎：研磨、超聲波、高壓（注意胞外酶的測定）（2）酶的萃?。狠腿∫?倍于起始材料緩沖液(pH7.5)的作用，中和從空泡中放出的大量酸；高離子強度(0.1-0.5)有助于將酶從結(jié)合的膜上解析下來；丙酮粉有助于將酶與脂肪或磷脂膜分離。注意事項：蛋白酶的抑制方法（低溫快速、抑制劑）制備丙酮粉用以解除酶與脂肪或磷脂膜的結(jié)合。除去核酸：調(diào)整pH沉淀（魚精蛋白硫酸鹽或鏈霉素）、水解3.4酶的分離方法（1）以大小或質(zhì)量為依據(jù)：離心（300000g)、凝膠過濾（Sephadex交聯(lián)葡聚糖、Bio-Gel交聯(lián)聚丙烯酰胺）、透析、超過濾（2）以電荷為依據(jù)：離子交換色譜（低離子

3、強度、適當pH）Sephadex、DEAE-纖維素、CM-纖維素；電泳（電荷、分子大小、分子形狀）紙、纖維素粉末、淀粉、聚丙烯酰胺；等電聚焦（pH梯度中的平衡位置）（3）以溶解度變化為依據(jù)：改變pH、改變離子強度、降低介電常數(shù)（4）以特異性結(jié)合位置為依據(jù)：親和色譜、親和洗提（5）其它方法：熱變性、在磷酸鈣凝膠柱上分級吸附、羥基磷灰石色譜、疏水色譜、用水溶性的非離子聚合物（聚乙二醇）沉淀、冷凍干燥濃縮分離方法分解(1)以大小或質(zhì)量為依據(jù)離心凝膠過濾透析和超過濾1.1離心原理：以質(zhì)量不同為分離依據(jù)離心力5000-50000g處理量可達幾升分離對象:細胞碎片、沉淀下來的酶高速離心速

4、度一般在20,000以下。超離心相對離心力場速度在75,000g以上，在80,000~250,000g之間。主要分離小分子量酶。沉降速度,離心法（區(qū)帶離心法），等密度梯度離心法（沉降平衡法）。1.2凝膠過濾原理：不同大小的分子進入顆粒狀凝膠內(nèi)微孔的能力不同，能進入微孔的小分子被阻滯，不能進入微孔的大分子未被阻滯。換句話說，分離是因為不同分子在進入或不進入凝膠所經(jīng)過的路程不同而達到分離的目的。其他名稱：分子篩層析、凝膠滲透層析、排阻層析Sephadex(交聯(lián)葡聚糖）、Bio-Gel(交聯(lián)聚丙烯酰胺）酶后期處理（小量試樣）葡聚糖凝膠操作流程：1）選擇根據(jù)分子量大小范圍選擇凝膠。凝

5、膠如:G50排阻1,500-30,000（Sephadex）還有粗，中，細分，細的分辯率高,流速慢；粗的分辯率低,流速快。2）溶漲水浸或沸水煮，快而可以殺菌，防止微生物污染。3）裝柱不能有氣泡，用緩沖液平衡4）上樣按柱床體積計算約1/40左右。然后用緩沖液洗脫。注意流速。5）再生稀鹽和緩沖液洗滌，保存在液體中，為防止微生物生長，加0.02%NaN3使用時要注意可能抑制你要分離的酶。聚丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺與甲叉丙烯酰胺聚合而成。Bio-GelP-2數(shù)字后面乘1000表示最高排阻分子量分離生物大分子的范圍與葡聚糖凝膠基本相同瓊脂糖凝膠是瓊脂去除瓊脂膠后得到D-半乳糖和6-脫水Se

6、pharose半乳糖相間排列而成。如：4B即瓊脂糖含量占4%。另外的商品Bio-GelA是瓊脂糖與丙烯酰胺交聯(lián)而成。Bio-GelCL，比上述二種化學穩(wěn)定性和機械強度更好，應(yīng)用更大。作用：濃縮，脫鹽等，分級分離1.3透析和超過濾透析膜：帶有微孔的篩子小于等于20000的大分子通過，更大的分子不通過。除去酶液的鹽、有機溶劑或低分子量的抑制劑超過濾：在0.29MPa氮氣壓力下使酶液透過透析膜。濃縮酶液(2)以電荷為依據(jù)離子交換色譜電泳等電聚焦2.1離子交換色譜取決于帶相反電荷基團的靜電吸引。DEAE-纖維素（二乙基氮基乙基-纖維素）結(jié)合帶負電荷基團，陰離子交換劑CM-纖維素（羧甲

7、基-纖維素）結(jié)合帶正電荷基團，陽離子交換劑離子交換纖維素:是纖維素作為母體，引入相應(yīng)的交換基團，蛋白質(zhì)不容易變性，交換容量大（0.2-1.0mg/克干膠）離子交換樹脂:聚苯乙烯樹脂引入相應(yīng)的解離基團，分陰，陽離子交換樹脂。有強酸，強堿，弱酸，弱堿。離子交換凝膠:葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠為母體，導入相應(yīng)的交換基團，交換容量更大2.5-4.5mg/克干膠）1）離子交換劑選擇：考慮酶穩(wěn)定性需要酶蛋白在くpI的pH條件下穩(wěn)定用陽離子交換劑。酶蛋白在〉pI的pH條件下穩(wěn)定用陰離子交換劑在﹤pIpH,﹥pIpH條件下