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1、酶的分離與純化分析酶分離純化的一般原則酶純化的基本步驟酶純化的常用方法酶的純化過程1、建立一個適當(dāng)?shù)臏y活方法2、酶源選材要以含酶豐富、取材方便、經(jīng)濟(jì)為原則3、酶的提取4、酶的提純5、酶的純度檢驗(yàn)一、酶的提取1、生物組織的破碎（1）機(jī)械（勻漿）法（2）超聲波法（3）凍融法（4）滲透壓法（5）酶消化法2、抽提典型的抽提液由以下幾部分組成：抽提液=離子強(qiáng)度調(diào)節(jié)劑+pH緩沖劑+溫度效應(yīng)劑(KCl、NaCl、蔗糖)(各種緩沖液)（甘油、二甲基亞砜）+蛋白酶抑制劑+防氧化劑+重金屬絡(luò)合劑+增溶劑（PMSF、DIFP）(DTT、巰基乙醇)EDTA、檸檬酸(TritonX-100)通常都用0.3m
2、ol/L的蔗糖溶液或0.15mol/LKCl溶液抽提。3蛋白質(zhì)抽取如何開始？5W基本原則材料來源：材料取得與保存均質(zhì)及抽?。捍_實(shí)做好第一步鹽析及沉澱法：最經(jīng)濟(jì)方便方法二、酶的提純酶的提純手段一般都是依據(jù)酶的分子大小、形狀、電荷性質(zhì)、溶解度、專一結(jié)合位點(diǎn)等性質(zhì)而建立的。要得到純酶，往往需要將各種方法聯(lián)合使用。常用的提純方法酵素的純化過程可分為三個階段：(1)粗蛋白質(zhì)(crudeprotein)︰採樣→均質(zhì)打破細(xì)胞→抽出全蛋白，多使用鹽析沉澱法；可以粗略去除蛋白質(zhì)以外的物質(zhì)。(2)部分純化(partiallypurified)︰初步的純化，使用各種管柱層析法。(3)均質(zhì)酵素(homog
3、eneous)︰目標(biāo)酵素的進(jìn)一步精製純化，可用製備式電泳或HPLC。酶的純化及分析方法鹽析沉澱法可分離出樣本中的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，會因溶液中其它鹽類濃度的改變而增減，可利用來沉澱蛋白質(zhì)。其原理是因於蛋白質(zhì)分子表面電荷的改變，或者分子上極性或非極性區(qū)域與水分子間作用結(jié)果?！鳆}濃度對蛋白質(zhì)溶解度的影響：●鹽溶Salting-in:加鹽使蛋白質(zhì)溶入水溶液中●鹽析Salting-out:加鹽使蛋白質(zhì)由水溶液中沉澱出來設(shè)計純化步驟時，需考慮下列各項要求a.高活性b.高回收率c.高純度d.方便與快速組合純化步驟a.組合標(biāo)準(zhǔn)(1)已知的酵素，可依照已發(fā)表的步驟進(jìn)行，有問題再作改進(jìn)
4、。通常都是以硫酸銨分劃-膠體過濾-離子交換為骨幹，再加上其它方法，組成全部流程。(2)對完全未知的酵素，可循此骨幹先試行純化，看其結(jié)果如何再加改進(jìn)。(3)不要忘記利用該酵素的特殊性質(zhì)來純化，如在其pI沉澱性、特別的疏水性、有專一的抑制劑或熱穩(wěn)定性等。近朱者赤、近墨者黑，物以類聚，不論人類或是分子皆同色譜的類型.常用的層析方法膠體過濾法膠體過濾屬partition層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為膠體孔隙內(nèi)的緩衝液。溶質(zhì)(樣本蛋白質(zhì))根據(jù)其分子量的大小，決定分佈在這兩相的比例。分子量大的不易進(jìn)入膠球，隨流動相溶離；分子量小的，則易竄入膠球內(nèi)的固定相，而被延滯流出膠柱。分子的形狀、大
5、小均為影響因素，即與其分子半徑(Stokesradius)有關(guān)，與分子量不完全成正比關(guān)係；但一般均視蛋白質(zhì)為球形，故其形狀較無影響力。膠體過濾法在操作時，有些內(nèi)在的問題，會影響結(jié)果的好壞：(1)擴(kuò)散及亂流：由於是在液相中進(jìn)行，樣本在膠柱中的擴(kuò)散現(xiàn)象相當(dāng)顯著；又因液體在膠球間流動時，受重力及對流的影響，會造成亂流。擴(kuò)散及亂流都會使膠體過濾的解析力降低甚多。(2)管柱設(shè)計不良：經(jīng)常是致命的傷害，例如無效空間(deadvolume)過大、緩衝液進(jìn)入膠體時流動不均、溶離液出口端的管路太長或太粗等。管柱操作單擊顯示管柱操作的詳細(xì)步驟離子交換法離子交換法乃利用分子的帶電性質(zhì)進(jìn)行分離，解析力好且
6、具多樣性，是重要而應(yīng)用極廣的純化方法。原理概述a.離子交換法是一種adsorption層析法，流動相為溶離緩衝液，固定相為介質(zhì)擔(dān)體表面的帶電基團(tuán)。樣本中各種離子，與介質(zhì)表面帶電基團(tuán)間的親和力強(qiáng)弱不同，吸附上去之後，可使用不同離子濃度的緩衝液，分別溶離出這些成分■環(huán)境影響分子的帶電性質(zhì)b.兩大類離子交換介質(zhì)由介質(zhì)帶電基團(tuán)的不同，可分為兩大類：介質(zhì)-帶電基團(tuán)(counterion)(1)陽離子交換介質(zhì)(cationexchanger)：擔(dān)體-陰離子基團(tuán).....陽離子(2)陰離子交換介質(zhì)(anionexchanger)：擔(dān)體-陽離子基團(tuán).....陰離子色層焦集法樣本蛋白質(zhì)進(jìn)入色層焦集管
7、柱後，先遇到較高pH環(huán)境(介質(zhì))，通常高於其pI而帶負(fù)電，因此會結(jié)合到介質(zhì)上。當(dāng)Polybuffer開始注入管柱，降低環(huán)境pH，使樣本分子失去負(fù)電荷而溶離下來；蛋白質(zhì)便依pI大小順序，pI高的先溶離出來；同時會集中在其pI的地方，成為一條極細(xì)色帶，故稱為焦集法。■專一性結(jié)合力量的構(gòu)成因素：I.ConformationalMatch:VanderwaalsinteractionII.InteractionForces:(1)Hydrogenbond(2)Hydropho
