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1、WesternBlot實驗方法及注意事項實驗原理:WesternBlot印跡方法，又稱為免疫印記，是將獲得的蛋白質(zhì)樣品通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，對不同分子量的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，并通過轉(zhuǎn)移電泳將凝膠上分離到的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至固相支持物(NC膜或PVDF膜)上，用抗靶蛋白的非標(biāo)記抗體(一抗)與轉(zhuǎn)印后膜上的靶蛋白進(jìn)行特異性結(jié)合，再與經(jīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記(偶聯(lián))的二抗結(jié)合，最后用ECL超敏發(fā)光液試劑檢測。如果轉(zhuǎn)印膜上含有靶蛋白，經(jīng)X光片曝光、顯影后，則會在X-光片上出現(xiàn)特異性蛋白條帶。實驗材料：分離膠及積層膠溶液、水飽和異丁醇、lXTris?Cl/SDS,pH8.8、蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)混合物、1XSD
2、S電泳緩沖液、電泳裝置及夾子、玻璃板、灌膠支架、緩沖液槽等附件、0.75mm封邊墊片、0.75mm樣品梳子、50P1微量加樣器、恒流電源常用試劑：1)30%丙烯酰胺/0.8%N，N’-亞甲丙烯酰胺將30克丙烯酰胺和0.8克N，N’-亞甲丙烯酰胺溶于總體積為60ml水中，加熱至37°C溶解之，補(bǔ)加水至終體積為100ml。0.45um微孔濾膜過濾除菌，查證該溶液pH應(yīng)不大于7.0,置棕色瓶中保存。小心：丙烯酰胺具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性并可通過皮膚吸收，其作用具有累積性。稱量丙烯酰胺和N，N’-亞甲丙烯酰胺時應(yīng)戴手套和面具?？烧J(rèn)為聚丙烯酰胺無毒，但也應(yīng)謹(jǐn)慎操作，因為它還可能含有少量未聚合材料。2)4XT
3、ris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH20中溶解91gTris堿(1.5mol/L),用lmol/L調(diào)節(jié)pH至8.8,補(bǔ)加H20至體積500ml。用0.45um濾膜過濾溶液,再加入2gSDS[0,4%(w/v)],于4"C可保存1月。3)4XTris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH20中溶解6.05gTris堿(0.5mol/L),用lmol/L調(diào)節(jié)pH至6.8,補(bǔ)加H20至體積100ml。用0.45um濾膜過濾溶液，再加入0.4gSDS[O.4%(w/v)],于4°C可保存1月。4)4XSDS電泳緩沖液Trisbase24.2g、Glycerin115.3g>20%SDS
4、20ml加水至總體積1000ml。應(yīng)用時稀釋4倍即為1XSDS電泳緩沖液(Tris0.05M,Glycerin0.38M,SDS0.1%)o1)TEMED(N,N,N’，N’-四甲基乙二胺)TEMED通過催化過硫酸銨形成自由基而加速丙烯酰胺和N,N’-亞甲丙烯酰胺的聚合。2)10%過硫酸銨過硫酸銨提供驅(qū)動丙烯酰胺和亞甲丙烯酰胺聚合所必需虬自由基?？捎萌ルx子水配制小量10%（?八）虬貯存液并保存于4°C。由于過硫酸銨會緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。實驗步驟：轉(zhuǎn)染后的樣品，收毒，12000rpm離心，2min,去上清，細(xì)胞碎片就直接進(jìn)行下面步驟：（1）加入10xRIPAbuffer/每孔200ul
5、,4°裂解30min。（2）準(zhǔn)備熱變性，用八連管，每孔加入5xloadingbuffer5wl。（3）用20u1移液槍，將裂解后的細(xì)胞取出20u1，加入對應(yīng)的八連管中，并吹打混勻。（4）封口，用PCR儀進(jìn)行熱變性處理：97°8min0（5）4°儲存變性后的樣品，待檢。1、SDS-PAGE凝膠的配制預(yù)先配制混合液（Tris-HCL/Acr-bis/SDS/H20），APS以及TEMED在配制凝膠時現(xiàn)加。分離膠：用1.5MTris-HCL8.8、10%分離膠。（所謂的10%濃度為Acr-Bis的濃度，即丙烯酰胺的濃度，用水定容，其他成分不變）；濃縮膠：用lMTirs-HCL6.8,濃度：5%。2
6、、上樣電泳：所用梳子為15孔，Marker占用一孔，故每塊凝膠可以檢測14支樣品。上樣量：Marker：5U1/孔；樣品：20ul/孔；參數(shù)：80V,待樣品跑出上樣孔；120V,樣品進(jìn)入分離膠；200V，直至結(jié)束（藍(lán)色指示帶到凝膠底部即完成電泳）3、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜三明治結(jié)構(gòu)順序：黑色板、網(wǎng)墊、一層濾紙、凝膠（習(xí)慣將Marker放在右側(cè)）、NC膜（在膜的蛋白面左上角做好標(biāo)記）、兩層濾紙、網(wǎng)墊、白色板。備注：所用的濾紙也分粗糙面和細(xì)膩面，細(xì)膩面對著凝膠和NC膜，粗糙面對著網(wǎng)墊。將三明治結(jié)構(gòu)的夾子放入電極時，黑色板對應(yīng)電極的黑色一面（負(fù)極）、白色版對應(yīng)電極的紅色一面（正極）。強(qiáng)調(diào)：凝膠和NC膜（硝化纖
7、維素膜）的順序千萬不要放反，所用的NC膜分粗糙面和光滑面，粗糙面為接受蛋白面，該面和凝膠直接接觸。蓋槽蓋時，同樣注意黑色對應(yīng)黑色、紅色對應(yīng)紅色；同樣導(dǎo)線電極連接電源的時候，也是黑色對黑色、紅色對紅色。上述任何一步弄反，都會導(dǎo)致蛋白轉(zhuǎn)膜失敗，切記。轉(zhuǎn)膜所用參數(shù)：穩(wěn)流45mA，過夜（999min）。4、封閉所用封閉液：5%Nonfatmilk,用TBST配制，RT（室溫），30min?lh（根據(jù)實際情況確定時間，
