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1、I實(shí)驗(yàn)步驟及其注意事項(xiàng)（2008-06-1713:27:35）一?實(shí)驗(yàn)步驟L組織塊稱重2.利用液氮、研缽粉碎組織塊3.加入緩沖液（每克組織7,MST（每克組織XulMi8/i1MST）,利用進(jìn)一步勻漿（毆―轉(zhuǎn)/分*1分鐘）維持4°C4.加入PKT（每克組織XulMi.'/ilMST），冰上孵育5?分鐘5.移入離心管4°C約:'（約轉(zhuǎn)）H分鐘?上清液為細(xì)胞裂解液可分裝?2TC保存T.進(jìn)行H比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度9.取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積誥白質(zhì)濃度），并加等體積的2X電泳加樣緩沖液亂沸水浴中7分鐘■?上樣IL電泳（濃縮膠分離膠JfciD□?電轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)膜（Ifi
2、i4,分鐘）O.膜用麗春紅染色，膠用考馬斯亮藍(lán)染色14.試劑盒顯色K.分析比較記錄些sJ0為的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)的資料L把聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。I）轉(zhuǎn)移緩沖液洗滌凝膠和硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜鋪在凝膠上，用《■!■移液管在凝膠上來回滾動(dòng)去除所有的氣泡。2）在凝膠/濾膜外再包一張51■濾紙（預(yù)先用轉(zhuǎn)移緩沖液浸濕），將凝膠夾在屮間，保持濕潤(rùn)和沒有氣泡。"將此濾紙/凝膠/薄膜濾紙按照廠家建議方法放入電泳裝置中，凝膠面向陰極。4）將上述裝置放入緩沖液槽屮，并灌滿轉(zhuǎn)移緩沖液以淹沒凝膠?！觯┌凑諒S家所示接通電源開始電泳轉(zhuǎn)移。b）轉(zhuǎn)移結(jié)束后，取
3、出薄膜和凝膠，棄去凝膠。2.將薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量標(biāo)準(zhǔn)顯現(xiàn)時(shí)取出，記錄下標(biāo)準(zhǔn)位置。X用IHi■水洗滌纖維素膜，必要時(shí)可用脫色緩沖液。4.膜置印跡緩沖液中于JTC保溫I小時(shí)。5.室溫下，用WS-葉緩沖液洗滌薄膜。b.用封口機(jī)將薄膜封入塑料袋中，盡對(duì)能不留空氣。Q袋的一角剪一緩沖液的小口，用透析袋夾緊?！?混合：/CS4IH微升》，印跡緩沖液中的抗體（I?毫升），加在裝薄膜的袋中，于室溫下?lián)u動(dòng)2小時(shí)（或4°C過夜）?用總體積3Mi久PBS-y緩沖液，分4次在一淺盤中洗滌薄膜，每次Fi久I??將連接生物素的羊抗兔斗微升溶于I?毫升印跡緩沖液flH微升
4、FCS）加在袋內(nèi),于室溫下?lián)u動(dòng)I小時(shí)。11.按步驟勺洗滌。12.加入抗生素蛋白■皿（4?微升溶于I?毫升印跡緩沖液/IH微升/CS）,于室溫下?lián)u動(dòng)。注意事項(xiàng)：中轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，空間結(jié)構(gòu)改變，因此那些識(shí)別空間表位的抗體不能用于檢測(cè)。這種情況對(duì)以將表達(dá)冃的蛋白的細(xì)胞或細(xì)胞裂解液中的所有蛋白先生物素化，再用酶標(biāo)記親和素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)中取膠和膜需帶手套。中心可以參考如下步驟進(jìn)行操作。I?收集蛋白樣品2］鳥［I亠“》可以使用適當(dāng)?shù)牧呀庖?，例如碧云天生產(chǎn)的■■及?細(xì)胞裂解液，裂解貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞或組織樣品。對(duì)丁?某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白，例如細(xì)胞核蛋白、細(xì)胞漿蛋
5、白、線粒體蛋白等，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組份蛋白，也可以使用試劑盒進(jìn)行抽提，例如碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒。收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致，需要測(cè)定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度。根據(jù)所使用的裂解液的不同，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y(cè)定方法。因?yàn)椴煌牡鞍诐舛葴y(cè)定方法對(duì)于一些去垢劑和還原劑等的兼容性差別很大。如果使用碧云天生產(chǎn)的片8%?及A細(xì)胞裂解液，可以使用i€ik蛋白濃度測(cè)定試劑盒。2.電泳＜DSBS-F^CC凝膠配制gK低凝膠可以參考一些文獻(xiàn)資料進(jìn)行配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的5??低凝膠配制試劑盒。該試劑盒提供了除水和配
6、膠器具外的所有試劑以及配制各種濃度的配方。樣品處理在收集的蛋白樣品中加入適量濃縮的S?S-Pii?蛋白上樣緩沖液。例如制或的蛋白上樣緩沖液。使用副的SBS-KXC蛋白上樣緩沖液可以減小上樣體積，在相同體積的上樣孔內(nèi)可以上樣更多的蛋白樣品。黠的gPikCC蛋白上樣緩沖液可以參考相關(guān)文獻(xiàn)資料配制，也可以使用碧云天生產(chǎn)的蛋白上樣緩沖液?Ool?rc或沸水浴加熱AS分鐘，以充分變性蛋白。0＞上樣與電泳冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到膠加樣孔內(nèi)即可。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，最好使用預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。電泳時(shí)通常推薦在上層膠時(shí)使用低電壓
7、恒壓電泳，而在澳酚藍(lán)進(jìn)入下層膠時(shí)使用高電壓恒壓電泳。對(duì)于的標(biāo)準(zhǔn)電泳裝置或類似電泳裝置，低電壓可以設(shè)置在t?-IMV高電壓可以設(shè)置在IMV左右?？梢圆捎闷胀ǖ碾娪緝x就可以滿足要求,也可以采用碧云天的多功能電泳儀。帶定時(shí)》。為了電泳方便起見，也可以采用整個(gè)gftkcc過程恒壓的方式，通常把電壓設(shè)置在IMV然后設(shè)定定時(shí)時(shí)間為分鐘。設(shè)置定時(shí)可以避免經(jīng)常發(fā)生的電泳過頭。通常電泳時(shí)溟酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳，或者可以根據(jù)預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)的電泳情況，預(yù)計(jì)目的蛋白己經(jīng)被適當(dāng)分離后即可停止電泳。X轉(zhuǎn)膜?我們推薦在中?■實(shí)驗(yàn)中選用W膜。硝酸纖維素膜膜》也對(duì)以使用，但
8、硝酸纖維素膜比較脆，扭操作過程中特別是
