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1、RNA干擾的應(yīng)用以及小分子RNA的作用摘要：RNA干擾是指在進化過程屮高度保守的、由雙鏈RNA誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基W的表達，所以該技術(shù)己被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。siRNA即胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(大約21?23bp)，具有介導(dǎo)mRNA切割的作用。miRNA是-?種20?24nt的單鏈小分子RNA,它是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，木身不具有開放閱讀框(ORF)。關(guān)鍵詞：RNAi
2、siRNAmiRNARNA—度被認為僅僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“過渡”，但越來越多的證裾表明，RNA在生命的進程中扮演的角色遠比我們早先設(shè)想的更為重要。RNA干擾(RNAinterference，RNAi)的發(fā)現(xiàn)使得人們對RNA調(diào)控基因表達的功能脊了全新的認識，而隨著對另一類小分子RNAmicroRNA(miRNA)的研究獲得突破性進展，更使得RNA成為當今世界的研究熱點之一.近兒年來RNA丁?擾(RNAinterference,RNAi)研究取得了突破性進展，被《Science》雜志評為2001年的十大科孕進展之一，#?名列2002年十大
3、科學(xué)進展之首。由于使用RNAi技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達，所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。1.RNA干擾和siRNA1.1RNAi是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。近年來，真核基因轉(zhuǎn)錄后關(guān)閉(沉寂)現(xiàn)象也得到了深入研究，對基因表達調(diào)控的機制的了解又宥了新突破，其中最重大的是20世紀90年代后期明確的RNA干擾。科學(xué)工作者發(fā)現(xiàn)在利用反義RNA阻止對應(yīng)mRNA翻譯蛋tl質(zhì)時結(jié)采并不穩(wěn)定，甚至宥時
4、正義RNA也能阻止mRNA翻譯出蛋白質(zhì)，這使得美閃學(xué)者Fire和Mello猜想，可能阻止mRNA翻譯的并不是有關(guān)的單鏈RNA而是其中混雜的痕量雙鏈RNA,進-步的實驗證實只要少量的雙鏈RNA就可干擾線蟲對應(yīng)基因的表達，而即使是大量的申鏈RNA(不管是反義還是正義的)并不起明顯作用。其后明確這異省普遍意義：雙鏈RNA是有效的基因關(guān)閉啟動者。病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內(nèi)，并利用宿主細胞進行轉(zhuǎn)錄時，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)屮的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多
5、個具冇特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA(大約21?23bp),即siRNA。siRNA在細胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC與外源性基因喪達的mRNA的同源區(qū)進行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA,切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細胞針對這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能
6、引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA,而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase,RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級siRNA，從而使RNAi的作用進一步放大，最終將靶mRNA完全降解。胡海燕等發(fā)現(xiàn)利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可抑制A549和NCI-H460細胞bcl-2基因表達，抑制效率高達50%以上。1.1RNAi具有的特征：①、RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機制；②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個內(nèi)源基因的mR
7、NA;③RNAi抑制基因表達兵宥很高的效率，表型可以達到缺失突變體表型的程度，而且相對很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠遠少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達，是以催化放大的方式進行的；④RNAi抑制基因表達的效應(yīng)可以穿過細胞界限，在不M細胞間長距離傳遞和維持信號甚至傳播至整個冇機體以及可遺傳等特點；⑤dsRNA不得短于21個堿基，并且長鏈dsRNA也在細胞內(nèi)被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA,并由siRNA來介導(dǎo)mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細胞非特兄性和全面的基因
8、表達受抑和凋亡；⑥ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個ATP依賴的過程?？赡苁荄iecer和RISC的酶切反應(yīng)必須由ATP提供能量。1.
