核酸檢測技術(shù)在血液篩查中的應(yīng)用及分析

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1、核酸檢測技術(shù)在血液篩查中的應(yīng)用及分析湖南省岳陽市中心血站414000【摘要】由于通過血液可以傳播乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病和梅毒等多種嚴(yán)重的傳染病。為了保障臨床用血的安全，血液制品的質(zhì)量，防止供受者血液及血液制品之間的交叉感染和采血及血液制品工作者的健康，必須防止上述疾病的感染者再次進(jìn)入供血隊(duì)伍，防止上述疾病病原體陽性血及成分血直接輸注于病人或用于血液制品牛產(chǎn)。為此必須用當(dāng)前質(zhì)量最好、最可靠的診斷試劑篩查供血員及其血樣。血清學(xué)酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測技術(shù)作為國家規(guī)定的血液篩查標(biāo)準(zhǔn)方法，但ELISA技術(shù)木身的固有缺陷卻成為進(jìn)一步提高臨床用血安全的障礙,主要

2、由病毒感染者存在較長的“窗口期”導(dǎo)致。而采用核酸檢測技術(shù)（NAT）能夠提高血液篩查的效率。木文就近年來國內(nèi)外NAT在血液篩查中的應(yīng)用情況進(jìn)行總結(jié)分析?！娟P(guān)鍵詞】核酸檢測技術(shù)；血液；篩查；應(yīng)用引言：核酸檢測和技術(shù)能夠直擊艾滋病病毒的RNA結(jié)構(gòu)，檢測血液中是否存在病毒核酸，診斷有無病原體感染。采用PCR技術(shù)，使用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室通用的擴(kuò)增試劑和自行研究開發(fā)設(shè)計(jì)的復(fù)合引物，覆蓋常見的HIV毒株，具有很高的靈敏度。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法，提高檢測的特異性，降低假陽性的概率。核酸檢測將艾滋病病毒的檢測窗口期縮短至口天，并且核酸檢測這項(xiàng)技術(shù)目前可將乙肝、丙肝病毒的

3、檢測“窗口期”分別由原來的50天、72天縮短到25天、59天。下文針對(duì)核酸檢測技術(shù)在血液篩查中的應(yīng)用和檢測原理進(jìn)行分析，并進(jìn)行探討。-、NAT用于血液篩查的意義及檢測原理輸血相關(guān)傳染病的預(yù)防和控制是采供血機(jī)構(gòu)的永恒主題。根據(jù)我國現(xiàn)行法律法規(guī)要求，采供血機(jī)構(gòu)對(duì)臨床供血檢測模式為：用兩種不同廠家的ELI-SA檢測試劑篩查HBsAg、抗?HCV、抗?HIV及梅毒螺旋體抗體（抗?TP）。這種篩查模式有效降低了輸血傳染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，特別是第三代酶免試劑的啟用，而艾滋病檢測已使用可同時(shí)檢測P24抗原的第四代試劑盒。但由于ELISA檢測的是抗原或抗體，“窗口期”、病毒變異以及低

4、水平攜帶者等漏檢問題相對(duì)突岀。血清學(xué)檢測HBsAg.抗?HCV和抗?HIV陰性不能排除HBV、HCV和HIV感染。研究報(bào)道表明，ELISA檢測合格的獻(xiàn)血者中,HCV-RNA陽性比率為0.01%?0.19%,HBV-DNA陽性比率為0.4%?0.92%；在HBV暴露率70%?90%的地區(qū)，獻(xiàn)血者中有7%?19%為HBsAg陰性HBV感染者，而HBsAg陰性的HBV-DNA陽性血中有18%可導(dǎo)致輸血后乙肝感染。PCR技術(shù)原理為：按照模板DNA序列，在DNA聚合酶的催化下，用4種dNTP來合成與模板DNA完全相同的拷貝，從而在多種DNA分子混合物中特異擴(kuò)增某一特定的D

5、NA片段。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。這樣就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線，當(dāng)熒光信號(hào)出現(xiàn)由本底進(jìn)入指數(shù)增長階段的拐點(diǎn)即達(dá)到熒光域值即為陽性,反之為陰。TMA則是一種轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增的過程。它使用Money鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA多聚酶兩種酶，在等溫條件酶催化下復(fù)制出上億的RNA序列拷貝。它包括3個(gè)主要步驟：首先是目標(biāo)捕獲，用洗滌劑破壞病毒包膜或衣殼,使RNA或DNA釋放，從而捕獲寡核昔酸結(jié)合于病毒核酸（至少2個(gè)保守區(qū)域）和

6、內(nèi)標(biāo)分子（IC）上，然后結(jié)合于磁性微粒的互補(bǔ)序列。第二步為擴(kuò)增，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7RNA聚合酶。逆轉(zhuǎn)錄酶用于產(chǎn)生一個(gè)具有目標(biāo)序列的DNA拷貝（含有T7RNA聚合酶的一個(gè)啟動(dòng)子序列），然后以DNA拷貝為模板，通過T7RNA聚合酶催化生成多個(gè)RNA擴(kuò)增子的拷貝。第三步檢測，即利用標(biāo)記有化學(xué)發(fā)光分子的檢測探針。在探針試劑中有兩種不同的叮噪酯（AE）分子，一種是標(biāo)記在內(nèi)標(biāo)特異性探針的閃光發(fā)光分子Ortho-flroro-AE；另--種是標(biāo)記在病毒特異性探針的輝光發(fā)光分子1-methyl-AEo二、NAT血液篩查面臨的問題及發(fā)展方向目前血液篩查核酸試劑已完全商品化

7、，其操作趨向于簡便和自動(dòng)化，其檢出率因檢測年份不同而有明顯差異也說明了核酸檢測試劑的質(zhì)量亦在不斷提高，因此選用合適的檢測系統(tǒng)與檢測模式成為血液NAT篩查應(yīng)首先考慮的問題。針對(duì)血液NAT檢測成本昂貴，有人提出血液病毒篩查采用一-遍ELISA結(jié)合一遍核酸檢測的模式，但需要對(duì)現(xiàn)有的ELISA試劑靈敏度提岀更高的要求，有待進(jìn)一步驗(yàn)證；另外實(shí)施血液集中化檢測有利于降低NAT檢測對(duì)基礎(chǔ)設(shè)施、檢測環(huán)境、人員培訓(xùn)的投入以及檢測費(fèi)用高的要求。目前，有些國家或地區(qū)已實(shí)行集中化檢測，可以充分利用資源，提高檢測質(zhì)量和檢測效率，提高成本效益。隨著近年來物流管理提高與網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展，我國實(shí)

8、施血液集中化檢測的基礎(chǔ)條