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《實驗25動物細胞線粒體及線粒體dna的制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、實驗25動物細胞線粒體及線粒體DNA的制備、酶切圖譜分析實驗目的：了解并掌握細胞線粒體(mitochondria)的提取原理及操作方法；丫解線粒體DNA的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析技術的原理及操作方法。實驗原理：線粒體是真核細胞中產生能量的重要細胞器。細胞中的能源物質一脂肪、糖、部分氨基酸在此進行最終的氧化，并通過偶聯磷酸化生成ATP,供給細胞生理活動之需。對線粒體結構與功能的研究通常是在離體的線粒體上進行的。1、線粒體的獲得細胞器的游離：細胞器的游離需要破碎細胞，破碎細胞常用的方法有化學法和機械法?；瘜W法有滲透壓作用、酶水解、自溶、凍融等幾種類型
2、。滲透壓作用是利用低表妞張力使細胞膜破碎，其作用溫和。自溶法是利川生物自生的活細胞內含有各種大量的消化酶，它們能將細胞膜洛解掉，同時也可能將線粒體膜溶解而使線粒體DNA釋放出來。凍融法是利用凍結和溶解的雙重作用，其作用可能會造成細胞膜和有膜結構的細胞器的破裂，其作用較為劇烈。機械法有研磨破碎、均質機破碎、超聲波破碎和勻漿器破碎。研磨破碎是利用盤磨研磨剪切破碎，作用中等。均質機破碎是用電帶動刀片進行剪切組織器官，其作用較劇烈，基本能夠將組織器官破碎。超聲波破碎是隨機地將組織細胞打成各種大小不同的片段，其作用非常劇烈。勻漿器破碎是一種手動的方法，由于勻漿器容器壁
3、較為粗糙，通過相互的摩擦，基本能將細胞膜磨破，其?作用溫和。要獲得較為完整而大:W:的線粒體，通常用STE抽提緩沖液浸泡材料并用玻璃勻漿器或研缽研磨破碎。線粒體的粗提：由于動物細胞的線粒體較小(15?19kb)，而真核細胞及其碎片、蛋白質沉淀物都比較大，所以用差速離心的方法可以將它們分離開來。差速離心法又叫分級離心法，是當非均一粒子(大小、密度各不相同)的懸浮液被離心時，各種粒子將以各自的沉降速率移至離心管底部，逐步在管底形成沉淀。為了分出特定組分，需進行一系列離心。首先選擇一個離心速度和離心時間，第一次離心時把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。這時所需要的組
4、分大部分還留在上清液中，又選擇第二個離心速度和離心吋間，使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。去掉上清液后，添加相同介質把沉淀懸浮起來，重復上述的差速離心，反復幾次，直至達到所需要的粒子純度為止。一般去細胞碎片及雜質的離心力(500?2000g)和離心時間(5?15min)，沉淀線粒體的離心力(12000?20000g)和離心時間(20?40min)。2、線粒體的鑒定JanusGreenB是對線粒體專一的活體染料，具有脂溶性，能跨過細胞膜，有染色能力的基團帶正電，結合在負電性的線粒體內膜上，內膜的細胞色素C氧化酶使染料保持氧化狀態(tài)，呈現藍綠色，而在胞質內，染
5、料被還原成無色。線粒體浸沒在JanusGreenB中能維持活性數小吋,可直接觀察到生活狀態(tài)線粒體的外形、分布及運動。線粒體制品經hnusGreenB特意染色后，光學顯微鏡下放大100倍鏡檢能夠發(fā)現是否有線粒體存在及它的大小、形狀、數量、結構。必須指出的是，只有具有活性的細胞色素C氧化酶才能夠把詹納斯綠B氧化，從而使它顯出顏色，因此，在實驗過程屮務必保持所取的材料的活性。通常，需要把生物材料賈于O'C?4°C的冰水浴低溫中，并且操作要迅速。3、動物線粒體DNA(mtDNA)的提取方法線粒體DNA(mtDNA)是一種封閉的雙鏈環(huán)狀分子，動物線粒體DNA為15?1
6、9kb。動物線粒體DNA具有分子量小、結構簡單、母性遺傳和進化速度快等特點，己廣泛應川于動物群體遺傳學和進化生物學等領域的研究。本實驗采用SDS裂解結合蛋白酶K消化的方法的提取mtDNA。SDS(十二烷基硫酸鈉)破壞線粒體膜并使蛋白質變性，從而游離出核酸，EDTA抑制細胞中DNase活性，蛋白酶K進一步將蛋白質降解成小肽。之后加入飽和乙酸鈉后，絕人部分線性大分子DNA和蛋白質在SDS作用卜變性形成沉淀，環(huán)狀mtDNA仍為自然狀態(tài)，通過高速離心，即W得到mtDNA。高鹽沉淀法操作簡單，易重復，產量多，可依需用量擴大反應體系，使mtDNA質量得以容易控制。4、m
7、tDNA的檢測檢測線粒體DNA濃度和純度通常有3種方法，即瓊脂糖凝膠電泳、限制性P、j切酶酶切和紫外分光光度計(UV)。瓊脂糖凝膠電泳可以通過泳帶顏色的深淺來判斷其濃度，通過是否有拖帶來確定其純度，還可以通過分子量標記來確定mtDNA的大小。限制性內切酶酶切可以知道是否為基因組，如果是基因組，則不能酶切出淸晰的條帶來；如果沒有基因組污染，只要該mtDNA存在此酶切位點，就會酶切出條帶來。紫外分光光度計可以測得A260和A260/A280,其?屮A260越大，其DNA的濃度也越大，反之越小。A260/A280—般介于1.6~2.0之間，如果A260/A280>
8、2.0,則此DNA可能有RNA污染，A260/A28
