細胞凋亡實驗

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1、細胞凋亡的檢測原理細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、閃質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被喬噬細胞喬噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)

2、上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNAladder(梯狀帶紋)的特征。而細胞壞死吋，DNA隨意斷裂為長度不一的片段，瓊脂糖凝膠電泳呈“彌散狀”(smearladders)條帶。一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。三尖杉酯堿(HT)是我國0行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等宥良好

3、療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02?5(ig/ml范圍內(nèi)作用2小時，即口J*誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實驗用ljig/mlHT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同吋，也奮少數(shù)細胞發(fā)生壞死。川Hoechst33342和碘化內(nèi)啦(propidiumiodide,PI)對細胞進行雙重染色，可以IX別凋亡、壞死及正常細胞。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而-?些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因

4、而可進行活細胞染色。恥^1^33342是~種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合(主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。再進一步用DNALadder測定觀察細胞凋亡情況。試劑三尖杉酯堿（HT）,300gg/ml,PI母液：500

5、ig/ml,Ho33342母液:2mmol/L。溶解緩沖液（含50mMTris、10mMEDTA、0.5%肌氨酸鈉、0.25mg/ml蛋白酶K）50ml,取1MTris-HClPH8.02.5ml、500mMEDTAPH8.01ml、10%肌氨酸鈉（先水浴溶解）2.5ml

6、、lmg/ml蛋白酶K12.5ml、SDW31.5ml0TBE電泳緩沖液：（含90mMTris、90mM硼酸、2mMEDTA）1000ml,取1MTris-HClPH8.090ml、0.5MEDTAPH8.04ml、0.45M硼酸200ml、SDW706ml。儀器設(shè)備熒光顯微鏡、載玻片、蓋玻片、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)。實驗材料人早幼粒白血病HL-60細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37°C,5%CO2條件下培養(yǎng)。方法1.三尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡1）實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37°C,5%CO2培

7、養(yǎng)箱培養(yǎng)。2）實驗前約2.5小吋，當(dāng)細胞密度達到70%,①號瓶加入三尖杉酯堿200pl，使終濃度為lpg/ml,②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小吋。2.HO33342和PI雙重染色鑒別三種細胞1）染色：將瓶中的細胞搖勻，取200pl于1.5ml的離心管屮，加入Ho33342母液2）il，PI20^1,染色15分鐘。2）滴片：取一載玻片，用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以上染色后的細胞懸液10Ml,加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察,區(qū)別三種細胞，并注意三者比例。注意1）.誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細胞時間耍準確。2.

8、）熒光顯微鏡卜*觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時耍盡量快。3.DNALadder測定1）收集2X106細胞（誘導(dǎo)凋亡細胞）離心沉淀，力叩.5ml溶解緩沖液（視細胞量加減量）混勻，置5（rc孵育1小時。2）加RNaseA（0.15mg/ml）于50°C孵育1小時。3）加10ul10mMEDTA（含1%低熔點瓊脂糖）4）于70°C加熱后，加入1.2%瓊脂糖中，電壓40V電泳1.5小吋（電泳緩沖液用TBE）。5）電泳結(jié)朿后于凝膠成像分析儀照相分析結(jié)果。