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《甘蔗梢腐病菌t-dna插入突變體庫(kù)的構(gòu)建和分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、甘蔗梢腐病菌T-DNA插入突變體庫(kù)的構(gòu)建和分析摘要甘蔗梢腐病是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物真菌性病害，其病原真菌為輪枝鐮孢菌(F．verticillioides)和層出鐮刀菌(F．proliferatum)。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化分別構(gòu)建了這兩個(gè)鐮刀菌種(菌株CNO．1和YN41)的突變體庫(kù)，并利用高效TAIL．PCR和菌落形態(tài)對(duì)突變體庫(kù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果分別構(gòu)建了庫(kù)容量為195的YN41突變體庫(kù)和庫(kù)容量為956的CNO一1突變體庫(kù)。從兩個(gè)突變體庫(kù)中分別隨機(jī)挑選6個(gè)轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果均為陽(yáng)性。通過(guò)菌落特征和致病性篩選YN41和CNO。1突變體庫(kù)，鑒定出生長(zhǎng)速度減慢且
2、致病力下降突變體1個(gè)(A5)，生長(zhǎng)速度減慢且致病力不變突變體1個(gè)(C8)，生長(zhǎng)速度加快且致病力增強(qiáng)突變體2個(gè)(A1、A2)，菌絲變濃密且菌絲疏水性變?nèi)跬蛔凅w1個(gè)(A3)；采用高效TAIL．PCR對(duì)這些轉(zhuǎn)化子的T-DNA側(cè)翼序列進(jìn)行擴(kuò)增，獲得了A1、A2、A3突變體的T-DNA側(cè)翼序列，通過(guò)BLAST鑒定到其插入位點(diǎn)(下游)基因，這些基因分別與色氨酸加氧酶和苯丙氨酸解氨酶等有關(guān)。CNO一1突變體庫(kù)中，篩選出生長(zhǎng)速度減慢突變體23個(gè)，色素變異突變體1個(gè)；對(duì)47株突變體進(jìn)行高效TAIL．PCR，擴(kuò)增插入位點(diǎn)側(cè)翼序列，得到有效序列22條，BLAST結(jié)果顯示，T-DNA的22個(gè)插
3、入位點(diǎn)分布在CNO．1的15條基因組scaffold上；對(duì)插入位點(diǎn)(下游)基因進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，生長(zhǎng)速度減慢突變體的插入失活基因分別與細(xì)胞分裂、DNA修復(fù)、△12脂肪酸脫氫酶、E3泛素連接酶等有關(guān)。關(guān)鍵詞：遺傳轉(zhuǎn)化，插入突變體庫(kù)，表型變異，側(cè)翼序列?！萬(wàn)方數(shù)據(jù)CONSTRUCTIONANDANALYSISOFT-DNAINSERTIONALⅣ叮TANTLIBRARIES0FFUSARIUMSPECIESCAUSEDSUGARCANEPOKKAHBOENGSUGARCANEABSTRACTSugarcanepokkahboengisaneconomicallyimpo
4、rtantfungaldiseaseworldwide，whicharecausedbytwospeciesofFusarium，F(xiàn)．verticillioidesandF．proliferatum．TwoT-DNAinsertionalmutantlibrariesofthesetwoFusariumspecies(isolateCNO一1andYN41)weregeneratedbyAgrobacteriumtumerfaciensmediatedtransformation(ATMT)andanalyzedbyHiTAIL—PCRandfungalcharacte
5、rizations．Theresultsindicatedthattwolibraryof195and956insertionalmutantsweregeneratedfromisolateYN41andCNO一1，respectively．SixmutantswererandomlyselectedfromeachlibraryandidentifiedtobepositivebyPCRamplification．FromYN41library,fivemutantswereidentifiedbyfungalcharacterizationandpathogeni
6、city,includingonemutant(A5)withslowergrowthphenotypeandlowerpathogenicity；onemutant(C8)withslowergrowthbutlessdifferentpathogenicity；twomutants(A1andA2)withmoregrowthandhigherpathogenicity；onemutant(A3)withdensermyceliumandweakerhydrophobicability．Theflankingsequencesofll萬(wàn)方數(shù)據(jù)T-DNAfromthe
7、mutantsA1，A2andA3wereamplifiedandsequencedbyHiTAIL—PCRandthenidentifiedtobeassociatedwiththegenesencodedtryptophandioxygenaseandphenylalanineammonialyasebyBLASTsearch．FromCNO一1library，23mutantsdecreasedtheirgrowth，andonechangeditsclonypigment．Twenty-twoflankingsequenceswe
