中藥材川貝母的dna分子標(biāo)記鑒定研究

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1、中藥材川貝母的DNA分子標(biāo)記鑒定研究摘要：貝母為常用貴重中藥材，藥用歷史悠久，我國(guó)貝母屬槓物已超過50種（變種），全國(guó)各地用作貝母的原植物種類繁多，此外商品貝母中還?；煊型霖惸?、唐菖蒲等偽品，嚴(yán)重影響了藥品的安全性和有效性，由于貝母類藥材的形態(tài)學(xué)上的差異較小，但是化學(xué)成分差異大，因此準(zhǔn)確地鑒定貝母類藥材的基源種類是一項(xiàng)極為重要的工作，為了探索貝母類藥材的快速、準(zhǔn)確的鑒別方法，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn)危钥朔壳皟H依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。關(guān)鍵詞：川貝母；DNA；PCR【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】1672-8602（2014）03-019

2、6-01川貝母系百合科植物川貝母FritillariacirrhosaD.Don>暗紫貝母Friti1lariaunibracteataHsiaoetK.C.Hsia、甘肅貝母FritillariaprzewalskiiMaxim.、梭砂貝母FritillariadelavayiFranch.>太白貝母FritillariataipaiensisP?Y.Li或瓦布貝母FritillariaunibracteataHsiaoctK.C?Hsiavar?wabuensisCS.Y.TangctS.C.Yuc）Z?D?Liu.S?WangctS.C.Chen的干燥鱗莖。按性狀不同分別習(xí)

3、稱〃松貝〃、〃青貝〃、〃爐貝〃和〃栽培品〃。川貝母性微寒而味甘苦，入心肺經(jīng)，能潤(rùn)肺、止咳、化痰，是一味珍貴的中藥材。〃中國(guó)藥典〃規(guī)定藥用川貝母為以上6個(gè)晶種，但我國(guó)貝母屬植物己超過50種，造成貝母基源極為復(fù)雜，并且隨著需求量的增加，基源混亂的現(xiàn)象呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，直接影響川貝母臨床用藥的安全、療效。運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)鑒定川貝母的真?zhèn)?，以克服目前僅依據(jù)形態(tài)、顯微特征及理化進(jìn)行鑒別的不足。使屮藥鑒定的手段從傳統(tǒng)的形態(tài)表征擴(kuò)展到了遺傳物質(zhì)DNAo特別是近年來微量DNA的PCR技術(shù)的應(yīng)用發(fā)展，使分子生物學(xué)技術(shù)與方法以特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，微量、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于近緣種、珍稀種、破碎藥

4、材等的鑒定。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)川貝母進(jìn)行了研究，建立了川貝母DNA分子標(biāo)記鑒定方法，為川貝母與其偽品的鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。1材料與儀器1.1藥材：（1）伊貝母對(duì)照藥材、平貝母對(duì)照藥材、湖北貝母對(duì)照藥材、浙貝母對(duì)照藥材、川貝母對(duì)照藥材（中國(guó)藥品生物制品檢定所）。（2）青貝、爐貝、濃蜜貝母（廣西錦瑩藥業(yè)有限公司）。1.2試藥：新型植物基因組DNA快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；10XPCR緩沖液、二氯化鎂（25mmol/L）、dNTP（10mmol/L）.鑒別引物：5'CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT

5、3'、無菌超純水、瓊脂糖、50XTAE電泳緩沖液、DNA分子量標(biāo)記物GM331（上海生工）；GclRcd核酸凝膠染色劑（BIOTIUM）；高保真TaqDAN聚合酶（5U/ul）、10X酶切緩沖液、SmaT（10U/ul）（Fermentas）o1.3儀器:H1850型臺(tái)式高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；K960型熱循環(huán)儀（杭州晶格儀器有限公司）；DYCP-31DN型電泳儀（北京六一儀器廠）;GSG-2000核酸/蛋口質(zhì)凝膠成像儀（珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司）o2方法2.1模板DNA提取:取本品0.lg,依次用75%乙醇51、滅菌超純水lnil清洗，吸干表面水分，置乳缽

6、中研磨成極細(xì)粉。取20mg,置1.5ml離心管中，用新型廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA［加入緩沖液API400卩1和RNA酶溶液（10mg/ml）4u1,渦漩振蕩，65°C水浴加熱10分鐘，加入緩沖液AP2130u1,充分混勻，冰浴冷卻5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘14000轉(zhuǎn)）10分鐘；吸取上清液轉(zhuǎn)移入另一離心管中，加入1?5倍體積的緩沖液AP3/E,混勻，加到吸附柱上，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）1分鐘，棄去過濾液，加入漂洗液700P1,離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過濾液；再加入漂洗液500ul,離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）30秒，棄去過濾液

7、；再離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘13000轉(zhuǎn)）2分鐘，取出吸附柱，放入另一離心管中，加入50口1洗脫緩沖液，室溫放置3?5分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘,將洗脫液再加入吸附柱中,室溫放置2分鐘，離心（轉(zhuǎn)速為每分鐘12000轉(zhuǎn)）1分鐘］,取洗脫液，作為供試品溶液，置4°C冰箱中備用。另取川貝母對(duì)照藥材0.lg,同法制成對(duì)照藥材模板DNA溶液。2.2PCR-RFLP反應(yīng)：鑒別引物:5"CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA3'和5'GCTACGTTCTTCATCGAT3