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《質(zhì)粒dna的提取與檢測(cè)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、質(zhì)粒DNA的提取與檢測(cè)1概述細(xì)菌質(zhì)粒是一些雙鏈、閉環(huán)的DNA分子，其大小范圍從1kb至2000kb不等。已經(jīng)存在形形色色的細(xì)菌類(lèi)群中發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒，這些質(zhì)粒都是獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外進(jìn)行復(fù)制和遺傳的遺傳單位。然而，它們又依賴(lài)于宿主編碼的酶和蛋白質(zhì)來(lái)進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。通常，質(zhì)粒含有編碼某些酶的基因，這些酶事實(shí)上在一定的環(huán)境下可能對(duì)細(xì)菌宿主有利。由質(zhì)粒產(chǎn)生的表型包括對(duì)抗生素的抗性、產(chǎn)抗生素、降解復(fù)雜有機(jī)化合物以及產(chǎn)生大腸桿菌素、腸毒素及限制酶與修飾酶等。質(zhì)粒DNA的復(fù)制由負(fù)責(zé)復(fù)制細(xì)菌染色體的多種酶來(lái)完成，但是不同的質(zhì)粒在宿主體內(nèi)所采用的酶迥然不同，而且在宿主中復(fù)制的程度也相差懸殊
2、。一些質(zhì)粒的拷貝數(shù)可高達(dá)700個(gè)／細(xì)胞，而另一些則只能維持在每套宿主細(xì)胞染色體僅對(duì)應(yīng)l個(gè)質(zhì)粒分子的最低水平上?？刂瀑|(zhì)?？截悢?shù)的基因處于包括DNA復(fù)制起點(diǎn)在內(nèi)的一個(gè)質(zhì)粒DNA區(qū)域內(nèi)。通常情況下，一個(gè)質(zhì)粒只含有一個(gè)復(fù)制起始區(qū)（復(fù)制子）。目前使用的大多數(shù)載體都帶有一個(gè)來(lái)源于pMB1質(zhì)粒的復(fù)制子。在正常生長(zhǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中可維持至少15～20個(gè)拷貝（帶有該復(fù)制子的質(zhì)粒）。一般認(rèn)為，這種多拷貝的質(zhì)粒是以松弛方式進(jìn)行復(fù)制的。pMB1復(fù)制子的復(fù)制并不需要質(zhì)粒編碼的功能蛋白，而是完全依靠宿主提供的半壽期較長(zhǎng)的酶。因此，即使蛋白質(zhì)合成并非正在進(jìn)行，復(fù)制依然能夠進(jìn)行。這樣，當(dāng)抑制
3、蛋白質(zhì)合成并阻斷細(xì)菌染色體復(fù)制的氯霉素或壯觀霉素等抗生素存在時(shí)，帶有pMB1復(fù)制子的質(zhì)粒將繼續(xù)復(fù)制，最后每個(gè)細(xì)胞中可以積聚兩三千個(gè)拷貝。單向復(fù)制從DNA復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，由一個(gè)RNA引物所引導(dǎo)，該引物的啟動(dòng)子位于復(fù)制起點(diǎn)上游大約550bp處。新生的RNA與DNA模板形成穩(wěn)定的雜交體，作為RNA酶H的底物，由RNA酶H切割從而產(chǎn)生引導(dǎo)DNA合成的引物。而RNAⅡ的成熟則由另一個(gè)不翻譯的RNA小分子（RNAI）所控制。RNAI編碼RNAⅡ的同一區(qū)段的DNA的互補(bǔ)鏈轉(zhuǎn)錄而來(lái)，它可與RNAⅡ結(jié)合，并阻止RNAⅡ折疊為三葉草結(jié)構(gòu)，而三葉草結(jié)構(gòu)對(duì)于形成穩(wěn)定的DNA-RNA雜交體又是
4、必不可少的。一個(gè)只有63個(gè)氨基酸的小蛋白（Rop蛋白）可以增強(qiáng)RNAI和RNAⅡ的結(jié)合，這一蛋白由位于復(fù)制起點(diǎn)下游400個(gè)核苷酸處的基因所編碼。Rop蛋白強(qiáng)化了RNAI對(duì)復(fù)制的負(fù)調(diào)節(jié)作用（圖）。圖帶pMB1（或ColE1）復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒在復(fù)制起始階段所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄物的方向及其粗略大小因此，可削弱RNAI和RNAⅡ之間相互作用的突變，將會(huì)增加帶有pMB1復(fù)制子的載體的拷貝數(shù)。。這些突變位于rop基因區(qū)或編碼RNAI和RNAⅡ的復(fù)制起點(diǎn)上游區(qū)內(nèi)。例如,pUC質(zhì)粒之所以拷貝數(shù)較高，是因?yàn)樵赗NAI的正常起始位點(diǎn)上游1個(gè)核苷酸的位置帶有G-A突變，結(jié)果RNAI轉(zhuǎn)錄物的起始位點(diǎn)
5、位于正常起始位點(diǎn)下游3個(gè)核苷酸的位置。RNAI5’-端的完整對(duì)于RNAI和RNAⅡ間的相互作用至關(guān)重要。因此，pUC質(zhì)?？截悢?shù)的增加看起來(lái)很可能是由縮短的RNAI和RNAⅡ結(jié)合效率降低所致。除了控制拷貝數(shù)以外，質(zhì)粒上編碼RNAI、RNAⅡ和Rop蛋白的區(qū)段也決定兩個(gè)不同的質(zhì)粒是否可以在同一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞中共存。利用同一復(fù)制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒不能穩(wěn)定地和平共處，可以稱(chēng)之為不相容質(zhì)粒。當(dāng)兩個(gè)上述質(zhì)粒被導(dǎo)入同一細(xì)胞時(shí)，它們?cè)趶?fù)制及隨后分配到子細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)彼此競(jìng)爭(zhēng)。由于質(zhì)粒是從細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒庫(kù)中隨機(jī)選取出來(lái)進(jìn)行復(fù)制的，所以?xún)蓚€(gè)不同的質(zhì)粒在一個(gè)單細(xì)胞中的拷貝數(shù)并不是總能保持相同。最初
6、在隨機(jī)過(guò)程中產(chǎn)生的微小差異，將很快導(dǎo)致兩種質(zhì)粒在拷貝數(shù)上更嚴(yán)重的失衡。在一些細(xì)胞中，一種質(zhì)粒處于優(yōu)勢(shì)；而在另一些細(xì)胞中，與之不相容的另一種質(zhì)粒卻占盡上風(fēng)。細(xì)菌生長(zhǎng)幾代后，占少數(shù)的質(zhì)粒將會(huì)喪失殆盡，在原始細(xì)胞的后代中可能含有兩種質(zhì)粒的任意一種，但不會(huì)兼而有之。在分子克隆的所有操作中最基本的或許要算核酸的分離純化，分離純化核酸總的原則是：①應(yīng)保證核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)完整性；②排除其他分子的污染。為了保證對(duì)核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在一級(jí)結(jié)構(gòu)中。核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式及其和其他大分子結(jié)構(gòu)結(jié)合的方式。核酸的純化方式應(yīng)符合
7、以下三個(gè)條件：①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；②其他生物大分子（如蛋白質(zhì)、多糖和脂類(lèi)分子）的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其他核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA分子，反之亦然。為了保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下事宜。①盡量簡(jiǎn)化操作步驟、縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞。②減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10的條件下進(jìn)行。③減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力的主要危害對(duì)象是大分子量的線型D
