藍(lán)莓品種及提取方法對(duì)藍(lán)莓葉生物活性的影響

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1、藍(lán)莓品種及提取方法對(duì)藍(lán)莓葉生物活性的影響?????藍(lán)莓(blueberry)屬于杜鵑花科越橘屬植物，多年生落葉或常綠灌木。藍(lán)莓果實(shí)含有眾多功能活性物質(zhì)，其營養(yǎng)價(jià)值日益受到人們的廣泛認(rèn)可。目前我國藍(lán)莓的種植面積逐年增大，2005年已達(dá)到667hm22]，而豐富的藍(lán)莓葉資源并未得到良好利用。一般當(dāng)作廢棄物直接丟棄，這既造成資源浪費(fèi)又帶來環(huán)境污染。研究表明，藍(lán)莓葉中含有豐富的黃酮、原花青素、花色苷等多酚類生理活性成分，還富含多種微量元素。目前國內(nèi)外對(duì)植物提取物的研究已有不少，對(duì)藍(lán)莓葉的研究主要集中在活性物質(zhì)的提取純化、穩(wěn)定性分析及其生理功能表征等方面，而對(duì)不同提取方法和成

2、熟度對(duì)藍(lán)莓葉生物活性的影響研究較少。????本研究對(duì)不同品種，不同成熟度和不同提取方法所得的藍(lán)莓葉提取物的生物活性進(jìn)行了對(duì)比研究，測定了藍(lán)莓葉提取物中的總酚含量、清除自由基(DPPH)能力和還原力大小，以求對(duì)藍(lán)莓葉生物活性有一個(gè)概括研究，為深化藍(lán)莓葉的開發(fā)利用提供有益的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1??材料與方法1.1??材料、試劑與儀器1.1.1??材料????藍(lán)莓葉子于2012年5月和6月采自上海市青浦區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園區(qū)。采摘后立即送往上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，將莖葉分離，洗凈，晾干。用真空冷凍干燥機(jī)將鮮葉干燥后用組織搗碎機(jī)搗碎，存放在--80℃冰箱中，備用。1.1.2??試劑??

3、??無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、無水碳酸鈉、福林酚、沒食子酸、抗壞血酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、氯化鐵國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1，1---苯基一2-三硝基苯肼(DPPH)梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司。1.1.3儀器????冷凍干燥機(jī)（Triad，美國Labconco公司）、水浴鍋（2875，美國賽默飛世爾科技公司）、恒溫振蕩器（420，美國賽默飛世爾科技公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，鞏義市予華儀器有限公司)、離心機(jī)(Z236K，德國Hermle公司)、UV-1800紫外分光光度計(jì)（Shimadzu，日本島津國際貿(mào)易（上海）有限公

4、司）等。1.2??方法1.2.1??藍(lán)莓葉提取????(1)50%乙醇提取：準(zhǔn)確稱取29樣品，加入24mL50%的乙醇，混勻。在室溫下避光振蕩30min，收集提取溶液，隨后以轉(zhuǎn)速12400r/min離心10min。上清液先用濾紙后用0.2μm的醋酸纖維素膜過濾。濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后定容至50mL并保存于--80℃冰箱，測試時(shí)間不超過1個(gè)月。????(2)95%乙醇提?。簻?zhǔn)確稱稱取59干燥樣品，用95%的乙醇在50℃下振蕩提取2次，每次用量約為33.33mL，時(shí)間30min。離心并將上清液合并，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，將提取液轉(zhuǎn)移至50mL的容量瓶中，用70%的乙醇溶液定容。

5、保存于--80℃條件，備用。????(3)酸堿提取：準(zhǔn)確稱取59干燥樣品，加入20mL2mol/LHC1，在沸水浴1.5h。冷卻后，加入20mL2mol/LNaOH，用70%的甲醇定容至100mL?；旌弦涸谑覝刂蟹胖?0min，隨后在19000r/min下離心5min。上清液保存于--80℃條件，備用。1.2.2??總酚的測定。????采用福林酚方法測定。取200μL-定濃度的提取物，加入1mL的福林酚試劑，充分混勻后加入0.8mL的20%的Na2C03溶液，充分混勻，在40℃水浴中反應(yīng)20min，在765nm的波長下測吸光度。結(jié)果以沒食子酸含量表示。1.2.3??

6、抗氧化性的測定????(1)清除自由基能力(DPPH)的測定：取0.75mL適當(dāng)濃度的藍(lán)莓提取液與1.5mL的0.09mg/mLDPPH甲醇溶液漩渦振蕩混勻。在室溫下避光放置5min，在517nm條件下測定吸光度。以抗壞血酸做標(biāo)曲，并計(jì)算抗氧化物含量。????(2)總抗氧化能力的測定：方法參照Kuda等方法。將1.0mL的提取物溶液與2.5mL的磷酸鹽緩沖溶液(50mmol/L，pH7.0)和2.5mL的鐵氰化鉀(1%)溶液充分混合，在50℃下反應(yīng)20min。反應(yīng)后加入2.5mL的三氯乙酸(10%)并離心(3000r/min)10min。取1.25mL的上清液加入1

7、.25mL的蒸餾水和0.25mL的氯化鐵(0.1%)溶液混勻。在700nm的波長下測其吸光度，吸光值越高，表示試樣還原能力越強(qiáng)。對(duì)照試驗(yàn)加入?BHT和單寧酸。2??結(jié)果與分析2.1??不同品種藍(lán)莓葉提取物的總酚含量????沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y一13.413α+0.1066，R2:0.9960，其中y為實(shí)驗(yàn)所得的吸光值，z為樣品濃度(mg/mL)。結(jié)果表明，沒食子酸濃度在0～0.06mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。????同一成熟度、品種，不同提取方法的藍(lán)莓葉中的總酚含量具有顯著性差異，不同提取方法中的總酚含量從大到小依次為方法1（50%乙醇振蕩提取