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《db37t31281-2018群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、ICS65.020.30B41DB37111地方標準DB37/T3128.1—2018I群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定DiagnostictechniquesforFowlAdenovirusGroupIinfectionPart1:IsolationandidentificationofFAdVgroupI2018-02-02發(fā)布2018-03-02實施山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局本標準按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由山東省畜牧獸醫(yī)局提出。本標準由山東省番牧業(yè)標準化技術(shù)委員會歸口。本標準主要起草單
2、位：山東農(nóng)業(yè)大學。本標準主要起草人：刁有祥、陳浩、唐熠、竇硯國、鄭肖強。I群禽腺病毒感染診斷技術(shù)第1部分：病毒分離鑒定1范圍本標準規(guī)定了I群禽腺病毒樣品的采集與保存、病毒的分離和鑒定等的技術(shù)要求。本標準中T群禽腺病毒分離與鑒定技術(shù)適用于T群禽腺病毒中12種血清型病毒的分離鑒定、間接免疫熒光試驗（TFA）適用于上述病毒的檢測、限制性片段長度多態(tài)性分析（RFLP）適用于對T群禽腺病毒12種血清型病毒的鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用
3、文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫3術(shù)語和定義下列定義和術(shù)語適用于本文件。3.1I群禽腺病毒FowladenovirusgroupI是引起家禽包涵體肝炎和肝炎-心包積液綜合征的病原，基于交叉中和試驗結(jié)果，該病毒可分為12種血清型。3.2間接免疫熒光試驗IndirectimmunofIuorescenceassay（IFA）用對應(yīng)某一種抗原的抗體（這里被稱為一抗）與細胞孵育結(jié)合，在采用對應(yīng)
4、一抗（也就是抗一抗）的抗體（這里被稱為二抗，二抗上偶聯(lián)有熒光素分子）與細胞孵育結(jié)合后在熒光顯微鏡下觀察，出現(xiàn)綠色熒光信號為陽性反應(yīng)。3.3限制性片段長度多態(tài)性分析RestrictionFragmentLengthPolymorphism（RFLP）利用限制性內(nèi)切酶能識別DNA分子的特異序列，并在特定序列處切開DNA分子，即產(chǎn)生限制性片段的特性，用于檢測DMA序列多態(tài)性。3.4LMH細胞雞胚肝癌上皮細胞系，來源于雄性雞肝臟腫瘤。4實驗室質(zhì)晁控制4.1實驗室符合GB19489和GB/T27401要求，實驗室必須為生物安全II級（
5、BSL-2級）及以上實驗室。4.1.1操作屮注意事項4.1.1.1從事PCR工作的實驗室盡可能分區(qū)，根據(jù)條件劃分出前處理區(qū)、核酸提取區(qū)、核酸擴增區(qū)、電泳檢測區(qū)，盡可能形成有效的物理隔離，且為單一流向，不得倒流。4.1.1.2特別注意電泳后的瓊脂凝膠要及時處理，避免對實驗室造成污染。4.1.1.3病毒分離區(qū)域的雞胚接種操作區(qū)和細胞培養(yǎng)操作區(qū)也應(yīng)遵循一定的布局原則，避免交叉污染。4.1.2注意個人防護和環(huán)境保護，電泳中用到的EB可誘發(fā)基因突變，試驗屮被EB污染的物品要有專用收集處，并通過適當?shù)姆绞剑ㄈ绶贌⒒蛩陀匈Y質(zhì)的醫(yī)用垃圾處
6、理公司）進行無害化處理。4.1.3生物樣品應(yīng)嚴格控制對環(huán)境的污染，試驗結(jié)束后應(yīng)將相關(guān)樣品收集高壓滅菌后，送有資質(zhì)的醫(yī)用垃圾處理公司做最終處理。4.2人員操作人員應(yīng)接受實驗室生物安全、實驗室質(zhì)量管理、細胞培養(yǎng)和分子生物學實驗室檢測技術(shù)培訓。熟悉生物樣品處理、細胞培養(yǎng)、以及核酸提収、基因擴增等分子生物學技術(shù)。4.3儀器設(shè)備a）生物安全柜；b）PCR儀；c）CO?恒溫培養(yǎng)箱（37°C恒溫）；d）臺式低溫高速離心機（最大轉(zhuǎn)速12000r/min）；c）電泳儀；f）電泳槽；g）紫外凝膠成像儀；h）2°C?8°C冰箱；i）-20°C冰柜
7、；j）微量移液器（最大量程分別為10uL、20uL.100uL.1000uL）,帶濾芯的槍頭；k）孵化器（37°C恒溫）；l）水平搖床；m）電子天平精度為：0.001g；n）電磁爐或微波爐；o）熒光倒置顯微鏡（FITC）o4.4試劑和材料除另有規(guī)定外，所有生化試劑均為分析純。a）磷酸鹽緩沖液（pH=7.0?7.4），見A.1；b）細胞培養(yǎng)液（含10%血清的DMEM培養(yǎng)基）；C）細胞維持液（含1%血清的DMEM培養(yǎng)基）；d）甲醇：丙酮（1:1）固定液；e）抗體稀釋液PBST,見A.2；f)商品化的FITC標記鼠抗兔熒光抗體；g
8、)兔抗I群禽腺病毒多克隆抗體(滅活疫苗免疫兔制備)；h)50%廿油；1)商品化的DNA提収試劑盒；j)rTaqDNA聚合酶(5U/uL)；k)10XPCRBuffer；l)dNTPs(2.5mniol/L)；m)商品化的DNA分子量標準，要求在100bp?2000bp之間，有5條以上的指示
