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《琥珀酸對(duì)原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、琥珀酸對(duì)原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷保護(hù)作用［摘要］本研究采用SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng),復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型，考察琥珀酸對(duì)心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的LDH漏出率的影響，并進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)及Westernblot考察琥珀酸對(duì)心肌細(xì)胞凋亡，cleavedcaspase-3及p-Akt的影響，探討琥珀酸對(duì)新生大鼠原代心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①琥珀酸31、25?500mg-L-1對(duì)原代心肌細(xì)胞活力無(wú)明顯影響，琥珀酸400,200,100,50mg-L-1均可顯著降低心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷LDH漏出率（PIC二（
2、A0、5%DMS0組-A加藥組）/A0、5%DMS0組X100%2、3心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型及體外加藥參考文獻(xiàn)復(fù)制心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷模型［5-7］,具體如下：①缺氧:取出35mm培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，無(wú)糖臺(tái)氏液洗細(xì)胞3次，每孔加入預(yù)先以95%N2-5%C02混合氣飽和15min的無(wú)糖臺(tái)氏液2mLo將培養(yǎng)皿敞蓋放入自制缺氧盒中，通入95%N2-5%C02混合氣（流速1L?min-1）,通氣15min后，夾閉進(jìn)氣管和出氣管并將缺氧盒置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)3h進(jìn)行缺氧。②復(fù)氧：打開(kāi)缺氧盒，取出培養(yǎng)皿，吸出缺氧液，每皿加入2mL含2、5%胎牛
3、血清的DMEM液，置培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2h（用于LDH檢測(cè)）或6h（用于流式，cleavedcaspase-3,Akt及p-Akt蛋白表達(dá)）。藥物以DMSO溶解，按照1：1000的比例加入培養(yǎng)上清液，分別在缺氧開(kāi)始和復(fù)氧開(kāi)始時(shí)各加藥1次。正常組細(xì)胞給予含相應(yīng)DMSO及糖的臺(tái)氏液，培養(yǎng)3h后，更換含2、5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2h或6h。2、4LDH釋放實(shí)驗(yàn)分成正常組、模型組、陽(yáng)性藥地爾硫卓45mg?L-1組、琥珀酸400,200,100,50mg?L-1組。復(fù)氧結(jié)束后，取出各組細(xì)胞復(fù)氧液，每皿加入2mL超純水，-70°C
4、低溫冰箱凍融1次裂解細(xì)胞，取各組細(xì)胞裂解液。釆用酶反應(yīng)動(dòng)力監(jiān)測(cè)法測(cè)定各組缺氧液、復(fù)氧液、裂解液的LDH含量，按下列公式計(jì)算LDH漏出率。LDH漏出率二（缺氧末上清LDH含量+復(fù)氧末上清LDH含量）/（缺氧末上清LDH含量+復(fù)氧末上清LDH含量+裂解液中LDH含量）X100%2、5流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分成正常組、模型組、琥珀酸400,200mg?L-1組。細(xì)胞復(fù)氧結(jié)束后，PBS洗細(xì)胞2遍，加入0、25%胰酶（500uL/皿）消化8min,加入500uL心肌細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，收集細(xì)胞，1000r?min-1離心5min,棄上清，加入1Xbi
5、ndingbuffer400uL重懸細(xì)胞至1X106個(gè)/mL,取200uL細(xì)胞溶液（約1X105個(gè)細(xì)胞）至5mLEP管，并分別加入5uLFITC-AnnexinV及5uLPI,混勻，常溫避光15min,上機(jī)分析。2、6cleavedcaspase-3,Akt,p~Akt蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)分成正常組、模型組、琥珀酸400,200mg-L-1組。細(xì)胞復(fù)氧6h后，棄培養(yǎng)液，PBS洗2遍，加入RIPA(臨用前加入PMSF及磷酸酶抑制劑)裂解液60uL,冰上裂解30min,收集細(xì)胞，12000Xg,4。(2離心5min,取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃
6、度，95°C沸水進(jìn)行蛋白變性，樣品-80￡保存。20ug蛋白上樣，采用5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行恒壓電泳(濃縮膠：50V；分離膠：100V),100V恒壓轉(zhuǎn)移75min(cleavedcaspase~3)或95min(Akt和p~Akt),5%BSA封閉1h,rabbitanti-cleavedcaspase-3(1:500),rabbitanti-Akt(1-1000)andrabbitanti-p-Akt(1：2000)，mouseanti-a-actin(1:2000)4°C孵育過(guò)夜，TBST洗膜9minX6次，5%BSA
7、封閉30min,抗兔二抗(1：4萬(wàn)，針對(duì)目的蛋白)或抗小鼠二抗(1:4萬(wàn)，針對(duì)a-actin)室溫孵育30min,TBST洗膜9minX6次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影及ImageLab軟件分析。2、7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS18、0統(tǒng)計(jì)軟件單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)以土s表示，組間差異采用Student-Newman-Keu1s(SNK)進(jìn)行比較，P圖1琥珀酸抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)Fig、1Effectofsuccinicacidonexpressionofcleavedcaspas
8、e—3incardiomyocytessubjectedto3hhypoxiafollowedby6hreoxygenation3、5琥珀酸對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞Akt,p-Akt蛋白表達(dá)的影響各組間Akt蛋白表達(dá)變化無(wú)明顯差異。與正常組相比，模
