sits在實(shí)驗(yàn)性心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷中的作用

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1、SITS在實(shí)驗(yàn)性心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用【摘要】　　目的闡明SITS所產(chǎn)生的心肌保護(hù)作用。方法建立缺氧/復(fù)氧損傷（A/R）模型及SITS預(yù)適應(yīng)模型，測(cè)定心肌細(xì)胞的搏動(dòng)頻率、細(xì)胞存活率以及細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的變化。結(jié)果SITS預(yù)處理能明顯提高A/R損傷后細(xì)胞存活率，減少LDH的漏出，與A/R組相比均有顯著性差異（P0.01）。結(jié)論SITS預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞A/R具有保護(hù)作用。此研究為尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護(hù)藥物的新靶點(diǎn)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。【關(guān)鍵詞】SITS缺氧/復(fù)氧損傷預(yù)處理心肌細(xì)胞　　自從Murry〔1〕發(fā)現(xiàn)“心肌缺血

2、預(yù)適應(yīng)保護(hù)作用”以來(lái)，研究缺血預(yù)適應(yīng)保護(hù)條件及其機(jī)理探索等成為20世紀(jì)90年代以來(lái)國(guó)際上研究心肌保護(hù)的熱點(diǎn)和前沿。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用Cl-通道及Cl-轉(zhuǎn)運(yùn)體系的抑制劑SITS（4-乙酰胺基4-異硫氐-2,2-二磺酸）可使多種原因誘導(dǎo)產(chǎn)生的心肌再灌注心律失常發(fā)生率顯著降低，提示SITS在心肌缺血再灌注損傷中起重要作用。　　本研究擬從細(xì)胞水平闡明SITS預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷（A/R）具有保護(hù)作用，進(jìn)一步尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護(hù)藥物的新靶點(diǎn)?！　?材料與方法　　1.1動(dòng)物Spraguer-Daa公司，其余化學(xué)試劑均為分析

3、純產(chǎn)品?！　?.3鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)參照Spector〔2〕等方法略加改進(jìn)，取新生大鼠（1～3d），在無(wú)菌狀態(tài)下取心室肌部分剪碎，加入0.1%胰蛋白酶溶液反復(fù)消化制成細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞于含15%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，然后置CO2培養(yǎng)箱（氣體配比為5%CO2及95%O2空氣，37℃）中培養(yǎng)?！　?.4實(shí)驗(yàn)分組與操作程序?qū)⒓?xì)胞懸液調(diào)成細(xì)胞濃度為5×105細(xì)胞/孔之后，按5×105細(xì)胞/孔接種于24孔培養(yǎng)板，最后置CO2培養(yǎng)箱（37℃，氣體配比為5%CO2及95%O2）中培養(yǎng)，隔天換培養(yǎng)液，頭3d加入0.1mMBrdU抑制成纖

4、維細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)第4天隨機(jī)分3組（n=8）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：①正常對(duì)照（Control）組換培養(yǎng)液后置培養(yǎng)箱孵育28h。②A/R組更換培養(yǎng)液后置培養(yǎng)箱孵育24h，再缺氧3h復(fù)氧2h。③SITS預(yù)適應(yīng)（SITS+A/R）組在心肌細(xì)胞培養(yǎng)液中加入各孔終濃度為2.05×10-4mmol/L的SITS預(yù)處理3h，其余處理同A/R組?！　?.5觀察指標(biāo)及方法實(shí)驗(yàn)各組結(jié)束后取培養(yǎng)上清液用倒置顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率。用生化分析儀測(cè)LDH活性、MTT比色法測(cè)細(xì)胞存活率。　　1.6統(tǒng)計(jì)分析定量資料以+s表示，采用系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS11.

5、5進(jìn)行單因素方差分析（One-wayANOVA），P0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。　　2結(jié)果　　2.1各處理組對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞搏動(dòng)的影響　　實(shí)驗(yàn)結(jié)束后在倒置顯微鏡下觀察并計(jì)錄各組心肌細(xì)胞搏動(dòng)的頻率。正常對(duì)照組心肌細(xì)胞搏動(dòng)相對(duì)恒定，節(jié)律規(guī)則；A/R組使心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率減慢、搏動(dòng)幅度減弱、節(jié)律不齊，有部分停搏，部分細(xì)胞搏動(dòng)幅度強(qiáng)弱不等，與control組相比，搏動(dòng)頻率有顯著性差異（P0.01）；SITS+A/R組對(duì)正常心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率（P>0.05）、搏動(dòng)幅度、節(jié)律無(wú)明顯影響，與A/R組比較有顯著性差異（P0.01）。結(jié)果見(jiàn)表1。

6、表1各處理組對(duì)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率的影響（略）　　2.2各處理組對(duì)缺氧復(fù)氧損傷后心肌細(xì)胞存活率的影響與正常對(duì)照組比，A/R組心肌細(xì)胞嚴(yán)重受損，細(xì)胞存活率較control組降低60.1%（P0.01）；SITS+A/R組明顯減輕上述A/R損害性變化，與A/R組相比細(xì)胞存活率升高55.3%（P0.01）。表明SITS預(yù)處理可明顯對(duì)抗心肌細(xì)胞A/R損傷所致的細(xì)胞存活率下降之作用。結(jié)果見(jiàn)表2。表2各處理組對(duì)心肌細(xì)胞存活率的影響（略）　　2.3各組對(duì)心肌細(xì)胞A/R損傷后LDH的影響與正常對(duì)照組比較，A/R組細(xì)胞懸液中LDH增加10倍（P0.0

7、1）；SITS+A/R組與A/R組比細(xì)胞懸液中的LDH活性降低（P0.01）；表明SITS預(yù)處理可對(duì)抗心肌細(xì)胞A/R損傷所致細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH活性升高的作用。結(jié)果見(jiàn)表3。表3各處理組心肌細(xì)胞LDH活性（略）　　3討論　　各種原因造成組織血液灌流量減少可使細(xì)胞發(fā)生缺血性損傷，恢復(fù)血液再灌注后，缺血性損傷進(jìn)一步加重的現(xiàn)象稱為缺血再灌注（I/R）損傷。早在20世紀(jì)50年代初，Harry就首先提出I/R對(duì)缺血的心肌是有害的，能加重心肌缺血損傷?！　”狙芯勘砻?，SITS預(yù)處理能明顯提高A/R損傷后細(xì)胞存活率，減少LDH的漏出；與A/R組相

8、比均有顯著性差異（P0.01）。隨著對(duì)SITS心肌保護(hù)作用及機(jī)制的進(jìn)一步了解，對(duì)尋找特異性阻斷劑，探討心肌保護(hù)藥物的新靶點(diǎn)具有重要的意義。【