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1、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)水稻成熟胚及抗褐飛虱基因植株的獲得 摘要：以水稻（OryzasativaL.）秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S成熟胚為材料，以攜帶有雙元載體的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）EHA105為載體進(jìn)行抗飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl的遺傳轉(zhuǎn)化，共獲得515棵再生植株，包括198株Bph14轉(zhuǎn)基因植株、72株Bphi008A轉(zhuǎn)基因植株和245株Osz！轉(zhuǎn)基因植株。PCR檢測(cè)結(jié)果表明，獲得的515株再生植株中，有244株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，3個(gè)不同抗褐飛虱基因中，轉(zhuǎn)Bvh14基因的
2、再生苗陽(yáng)性率最高，增加篩選次數(shù)能有效減少轉(zhuǎn)化所得的假陽(yáng)性植株?！ ￡P(guān)鍵詞：水稻（OryzasativaL.）；根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；抗褐飛虱基因 中圖分類號(hào)：S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2016）09-2392-04 近年來(lái)，褐飛虱遷入中國(guó)的蟲量大，由于目前大多數(shù)水稻（OrvzasativaL.）品種不抗蟲，尤其是一些主要的雜交稻品種，對(duì)褐飛虱等蟲害還有“超感蟲性”7（hyper-susceptibility）。目前，水稻褐飛虱已經(jīng)成為一種爆發(fā)力強(qiáng)、對(duì)水稻危害性極大的
3、蟲害。由于褐飛虱的危害多發(fā)生在水稻成熟灌漿期，此時(shí)若大量使用殺蟲劑，對(duì)水稻的污染會(huì)非常嚴(yán)重，這也是中國(guó)水稻生產(chǎn)中迫切需要解決的重要問(wèn)題。研究證明，利用抗褐飛虱基因培育抗蟲水稻品種是褐飛虱綜合防治中經(jīng)濟(jì)有效的方法。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合培育抗褐飛虱水稻品種，有效控制褐飛虱的發(fā)生與危害，可確保中國(guó)水稻生產(chǎn)持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展和國(guó)家糧食安全。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens）介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是對(duì)天然載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的一種模仿，已在水稻轉(zhuǎn)基因育種及功能基因組研究中被廣泛應(yīng)用，1994年以后，由于技術(shù)上的突破。相繼在不同水稻品種
4、中獲得成功，轉(zhuǎn)化效率也大大提高，如粳稻的轉(zhuǎn)化率一般在30%左右，最高可達(dá)到64.6%。本研究以育種上應(yīng)用的典型秈型兩系恢復(fù)系M5274和晚粳稻不育系N55S為材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)褐飛虱抗性基因Bph14、Bphi008A、Osgl進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，目的是通過(guò)3個(gè)抗褐飛虱基因的導(dǎo)入，探索水稻抗褐飛虱育種的新途徑，以期提高其產(chǎn)量和品質(zhì)?！ ?材料與方法 1.1植物受體材料 兩系恢復(fù)系M5274、晚粳稻不育系N55S，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所選育?！ ?.2農(nóng)桿菌菌株與質(zhì)粒載體 根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105，質(zhì)粒PCAMBIA1300
5、的T-DNA區(qū)含有潮霉素抗性基因（Hygr），抗褐飛虱基因Bph14、Bphi008A、Osgl由武漢大學(xué)提供?！ ?.3材料的處理及接種7 選取健康飽滿無(wú)病斑的成熟種子，除去穎殼，用75%乙醇浸泡1min，然后將種子置于新配制的0.1%氯化汞溶液中，攪拌10-12min。滅菌后用無(wú)菌水沖洗4-5次，最后將種子取出置于無(wú)菌濾紙上，待種子表面干燥后，以平擺法將其接種于各自不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶12-14粒。每個(gè)品種接30瓶?！ ?.4水稻組織培養(yǎng) 粳稻組織培養(yǎng)培養(yǎng)基見表1，秈稻組織培養(yǎng)基為L(zhǎng)Y培養(yǎng)基，購(gòu)自武漢博遠(yuǎn)生物科技有限公司。將成熟胚表
6、面按“1.3”的方法消毒后接種于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。 1.5農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化 根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程參照Hiei等的方法?！ ?）劃菌：取轉(zhuǎn)化后經(jīng)檢測(cè)有所需載體的農(nóng)桿菌保存菌液5-10μL，至YEB（加入濃度為100mg/L的卡那霉素）的固體培養(yǎng)基上涂板，30℃黑暗培養(yǎng)，直到長(zhǎng)出單菌落。將單菌落二次劃線培養(yǎng)農(nóng)桿菌24-36h，刮菌體于懸菌培養(yǎng)基中，30℃180r/min搖菌3-4h，調(diào)整菌液OD600nm至所需值?！ ?）侵染：用懸浮培養(yǎng)基稀釋菌液，直到OD600nm為0.1-0.9，將含農(nóng)桿菌菌液倒入已放好愈
7、傷的培養(yǎng)瓶中，根據(jù)菌液濃度在30℃搖床上侵染5-30min。倒掉菌液，用滅菌的濾紙將菌液吸干，用鑷子把愈傷組織轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，20℃黑暗培養(yǎng)48-72h?！ ?）洗菌：把共培養(yǎng)基上的愈傷組織轉(zhuǎn)入滅菌三角瓶中，用無(wú)菌水清洗5-6次，直到水不再渾濁。然后加入滅菌水（含有500mg/L頭孢霉素）120r/min28℃搖菌15-20min?！ ?）晾干愈傷：把水倒掉，把愈傷組織轉(zhuǎn)移到放有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，在超凈臺(tái)吹40-50min。7 5）把晾干的愈傷組織轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，分別進(jìn)行一輪和兩輪篩選培養(yǎng)。每輪25d左右，比較篩選的有
8、效性?！ ?）把篩選出的抗性愈傷組織進(jìn)行預(yù)分化、分化和生根培養(yǎng)。 1.6轉(zhuǎn)基因水稻植株的PCR鑒定 1.6.1轉(zhuǎn)基因植株總DNA的提取按CTAB法
