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《農(nóng)桿菌介導(dǎo)氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻植株獲得》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的氮高效利用轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得摘要：將從深海硅藻中克隆的與氮具有高度親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ｎａｔ３通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)入水稻品種中花１１，在含３０ｍｇ／ｌbａｓｔａ的選擇培養(yǎng)基上篩選，獲得４５６棵抗性植株，對ｎａｔ３目標(biāo)基因檢測，獲得３１３棵陽性植株，初步證明目標(biāo)基因已整合到中花１１基因組中。關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因水稻；硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；氮高效利用transgenichighnuseefficiencyriceobtainedbyagrobacteriumtumefaciensｚｈａｚｈｏｎｇ－ｐｉｎｇ，ｗａｎｂｉｎｇ－ｌｉａｎｇ，ｙｉｎｄｅ－ｓｕｏ，ｄｕｘｕｅ－ｓｈｕ
2、，ｑｉｈｕａ－ｘｉｏｎｇ（ｆｏｏｄｃｒｏｐｓｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ｈｕｂｅｉａｃａｄｅｍｙｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｗｕｈａｎ４３００６４，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｎａｔ３ｇｅｎｅｃｏｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈｈｉｇｈｎｉｔｒａｔｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｃｌｏｎｅｄｆｒｏｍｃｙｌｉｎｄｒｏｔｈｅｃａｆｕｓｉｆｏｒｍｉｓｗａｓｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄｉｎｔｏｒｉｃｅ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’ｖｉａａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ－ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ．４５６ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｒｉｃｅｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗｅｒｅｏｂ
3、ｔａｉｎｅｄｂｙｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｎｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｗｉｔｈ３０ｍｇ／ｌｂａｓｔａ．３１３ｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃｐｌａｎｔｓｗｅｒｅｇａｉｎｅｄｂｙｐｃｒａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｔａｒｇｅｔｉｎｇａｔｎａｔ３ｇｅｎｅ．ｉｔｗａｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｎａｔ３ｇｅｎｅｈａｄｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｇｅｎｏｍｅｏｆ‘ｚｈｏｎｇｈｕａ１１’．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：transgenicｒｉｃｅ；ｎｉｔｒａｔｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ｈｉｇｈｎｕｓｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ植物的生長需要合適的氮量，氮是限制植物生長的重要因素［１］
4、。硝酸鹽（ｎｏ３－）是植物主要氮源之一，硝酸鹽供應(yīng)量的不足經(jīng)常成為限制作物生長的因素［２－４］。但過量硝酸鹽如果沒有被植物吸收，極易通過淋失、滲透等途徑轉(zhuǎn)移到水環(huán)境中，造成水體硝酸鹽污染的潛在危險(xiǎn)，對生態(tài)環(huán)境和人體健康產(chǎn)生極為不利的影響［５］。氮肥施用量對晚稻產(chǎn)量和氮肥利用效率有影響，采用氮素運(yùn)籌可影響免耕移植水稻產(chǎn)量及氮素利用率［6，7］。因此，提高氮肥的利用效率，對于促進(jìn)氮肥的高效利用和減輕環(huán)境污染具有重要的意義。水稻是最早通過基因工程手段進(jìn)行品種改良的作物之一，我國的轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)也已實(shí)施，但提高水稻氮素利用率，培育氮高效利用的轉(zhuǎn)基因水稻研究方面的研究不多［8］，因此
5、迫切需要利用新的基因工程策略，培育氮高效利用的轉(zhuǎn)基因水稻新種質(zhì)。該研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將從深海硅藻中克隆的與氮具有高度親和性的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ｎａｔ３導(dǎo)入中花１１中，旨在培育氮肥高效利用的轉(zhuǎn)基因水稻，減少氮肥施用量，節(jié)約水稻生產(chǎn)成本，從而降低環(huán)境污染，促進(jìn)農(nóng)業(yè)高效節(jié)能、可持續(xù)發(fā)展。１材料與方法１．１材料用于研究的水稻材料為中花１１，植物表達(dá)載體由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)所劉昱輝博士惠贈，根癌農(nóng)桿菌菌株為ｅｈａ１０５。１．２方法1.2.1水稻胚性愈傷組織的獲得將成熟種子剝殼后放在５０或１００ｍｌ三角瓶中進(jìn)行常規(guī)消毒，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿約３５～４０粒，封口膜封好后于２８℃
6、暗培養(yǎng)。１．2.2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌在ｌａ培養(yǎng)基上２８℃培養(yǎng)2d后，用藥勺刮取少量菌斑懸浮于含有１００μｍｏｌ／ｌ的乙酰丁香酮的ｌｂ培養(yǎng)基，調(diào)整菌液濃度至ｏｄ６００nm＝０．６左右。將經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)的水稻成熟胚誘導(dǎo)的胚性愈傷組織置于農(nóng)桿菌懸浮液中，略微搖動后靜置５ｍｉｎ，然后將愈傷組織置于培養(yǎng)皿中無菌濾紙上，在超凈工作臺中吹干。最后將愈傷組織轉(zhuǎn)入添加有１００μｍｏｌ／ｌ的乙酰丁香酮的共培養(yǎng)基上，１８℃暗培養(yǎng)３ｄ。１．2.3抗性愈傷組織的篩選待愈傷組織共培養(yǎng)２～３ｄ，取出愈傷組織，用無菌水沖洗３～５次，每次搖動數(shù)次，直至水中不見絲狀菌體。然后用含２５０ｍｇ／ｌ羧芐青霉素的無菌水再清洗一
7、遍，置于無菌濾紙上吹干后，轉(zhuǎn)移至選擇培養(yǎng)基（添加２５０ｍｇ／ｌ羧芐青霉素以及３０ｍｇ／ｌbａｓｔａ）篩選抗性愈傷組織。每兩周將愈傷組織轉(zhuǎn)移至新選擇培養(yǎng)基上，約需３次繼代培養(yǎng)獲得抗性愈傷組織。１．2.4抗性植株的獲得將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培育，每一瓶中可放置３～４塊不同克隆的愈傷組織。１周后愈傷組織開始轉(zhuǎn)綠，３周后幼苗長到５ｃｍ時，可進(jìn)行生根培養(yǎng)。１．2.5轉(zhuǎn)基因植株的ｐｃｒ檢測ｃｔａｂ法提取水稻總ｄｎａ。ｐｃｒ擴(kuò)增
