山羊sprn基因真核表達載體構建

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1、山羊SPRN基因真核表達載體構建摘要：以山羊小腦cDNA為模板，利用RT-PCR法擴增獲得了SPRN基因完整編碼區(qū)片段，將其連接到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109后，篩選并鑒定陽性克隆，通過序列測量，將序列正確的片段雙酶切后連接到真核表達載體pEGFP-N1上。結果表明，成功構建了山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的真核表達載體。關鍵詞：山羊；SPRN基因；RT-PCR；真核表達載體中圖分類號:S827文獻標識碼：A文章編號:0439-8114（2013）22-5618-03SPRN基因編碼Shadoo（簡稱Sho）蛋白，在結

2、構上與PrPc類似。Sho蛋白約包括130?150個氨基酸，N端保守，含有最多6個富含Arg的四肽XXRG（X是G、A或S）重復的堿性區(qū)域和約20個AA與PrPc有非常高同源性的疏水區(qū)。與N端相比，C端不夠保守，與PrP差異較大，包含一個糖基化位點，末端是GPI錨的信號肽。Sho蛋白氨基酸在不同物種中差異不大［1］。Sho蛋白具有與PrPc相似的神經(jīng)保護作用，因此認為SPRN基因是一個與TSEs有關的一個候選基因［2］。2007年8月發(fā)現(xiàn)了稱為'Shadoo'的阮病毒蛋白，證明了這種理論上的病毒蛋白真正存在，同時也觀測到了這種病

3、毒在反病毒傳染病過程中的意外改變，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Shadoo蛋白具有類似于PrPc的保護性，降低了阮蛋白感染的水平［3］。這一發(fā)現(xiàn)可能會對于阮病毒蛋白的功能，阮病毒如何在動物之間進行傳播，以及如何導致腦細胞死亡等問題的研究提供新的思路。SPRN基因在小鼠、綿羊、倉鼠、人、大鼠和牛腦組織轉(zhuǎn)錄水平高，在其他組織中也檢測到表達［4-10］o本研究以小腦組織作為試驗材料擴增構建了山羊SPRN基因的真核表達載體，為研究該基因的表達定位、抗體制備以及蛋白的功能提供了必要的條件。1材料與方法1.1材料限制性內(nèi)切酶、引物合成與測序、DNA凝膠回

4、收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；Trizol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、T4DNA連接酶、pMD19-T、TaqDNA聚合酶、GCBufferII、dNTPs購自寶生物工程（大連）有限公司。1.2方法1.2.1山羊小腦組織總RNA的提取RNA的提取按照Trizol試劑說明書進行。1.2.2特異性引物的設計與合成根據(jù)GenBank中山羊SPRN基因的序列,利用PrimePremier5.0軟件設計引物,并在正向引物引入限制性BglII酶切位點5’-GAAGATCTGAGGTCTCCTCCGTCCT-3z

5、,在反向引物引入EcoRl酶切位點5’-CGGAATTCCACAGGCCTACCGCA-37。1.2.3山羊SPRN基因完整編碼區(qū)的PCR擴增1)cDNA第一鏈的合成。以提取的山羊小腦組織總RNA為模板，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶進行cDNA第一鏈合成：配制模板RNA10uL,oligo(dT)18primer5.00uL,RNasefreedH2O15uL的混合液；70°C保溫10min,冰浴2mino短暫離心后分別加入10uL5XM-MLVBuffer,2.50uL10mmol/LdNTPMixture,1.25uLRecomb

6、inantRibonucleaseInhibitor,1.25uLReverseTranscriptaseM一MLV禾口5.00uLRNasefreedH20；42°C60min,70°C保溫15min后冰上冷卻。所得產(chǎn)物直接用于PCR。2)PCR擴增。PCR反應總體積為20uL,含10XLAPCRBuffer2uL,2.5mmol/LdNTPs2pL,正向和反向引物各1uL(10pmol/uL),DNA模板1uL,LATaqDNA聚合酶0.4uLo混勻后瞬間離心，于PCR儀中進行擴增反應。PCR反應程序為：96°C預變性3mi

7、n；96匸變性45s,68°C退火30s,72°C延伸30s,36個循環(huán)；72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并按照試劑盒說明書回收產(chǎn)物。1.2.4山羊SPRN基因與T載體的連接、轉(zhuǎn)化、篩選與測序?qū)⒓兓蟮腜CR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上。反應體系總體積為10uL,其中SlutionI5uL,pMD19-T載體1uL,純化的PCR產(chǎn)物4uL,16°C連接3ho在-80°C冰箱取100pL感受態(tài)細胞放置冰上，待融化后，將5nL連接產(chǎn)物加入感受態(tài)細胞，在冰上放置30min,42°C熱激90s,立即冰浴2min,

8、加入890卩L無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37°C振蕩(180r/min)1h,離心(4000r/min,1min),棄掉一部分上清液，取200nL涂于預鋪有IPTG和X-gal的含Amp瓊脂平板上，37°C平放1h后倒置培養(yǎng)過夜。1.2.5構建真核表達載體1)p