pcr相關(guān)技術(shù)在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用

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1、PCR相關(guān)技術(shù)在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用2006年第4期（總第105期）廣西熱帶農(nóng)業(yè)45PCR相關(guān)技術(shù)在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用宋卡魏王星云張榮意（華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)環(huán)植學(xué)院，海南億州571737）摘要:PCR及其相關(guān)技術(shù)用于體外擴(kuò)增DNA,RNA具有靈敏，快速，簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用丁?植物病原細(xì)菌的檢測(cè).本文綜述了real一timefluoreseentPCR,REP一PCR,Irlq?hmo—RCR,RAID—PCR,Nested—PCR等技術(shù)的原理及其在植物病原細(xì)菌檢測(cè)和鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀.關(guān)鍵詞:PCR植物病原細(xì)菌檢測(cè)鑒定聚合酶鏈反應(yīng)

2、（polymerasechainreaction,PCR）是1983年由美國(guó)PE_Cetus公司的KaryMullis等n發(fā)明,1985年公開(kāi)報(bào)道的一種體外核酸擴(kuò)增系統(tǒng).PCR及其相關(guān)技術(shù)具有快速，靈敏，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)，醫(yī)學(xué)，微生物學(xué)等領(lǐng)域.且在這些領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景?傳統(tǒng)的PCR技術(shù)在植物病原細(xì)菌學(xué)的檢測(cè)應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛12,3,4,5,61但是由于植物病害的多樣性以及植物病原細(xì)菌的復(fù)雜性，使傳統(tǒng)的PCR技術(shù)較難滿足需要，由此專家學(xué)者們研制出了許多以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)，如Real一timefluo

3、rescentPCR,rep一PCR,?nnluno—PCRJTS—PCR等?這些方法使植物病原細(xì)菌的檢測(cè)更加方便，快捷，靈敏，本文簡(jiǎn)要介紹一些PER相關(guān)技術(shù)的原理及其在植物病原細(xì)菌檢測(cè)屮的應(yīng)用概況.1Real一timefluorescentPCR其原理是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，增加1條雙熒光標(biāo)記的核酸雜交探針，即Taqman探針;隨著實(shí)吋PCR反應(yīng)體系的進(jìn)行，每進(jìn)行一次DNA擴(kuò)增，就有一個(gè)探針被切斷，同時(shí)熒光信號(hào)值被記錄下來(lái),且與擴(kuò)增產(chǎn)物的量產(chǎn)生一對(duì)一的對(duì)應(yīng)關(guān)系，產(chǎn)物的量越大，熒光信號(hào)就會(huì)越強(qiáng)，也即反應(yīng)起始的模板數(shù)越高,就越容易達(dá)到個(gè)熒光信號(hào)閾值，循環(huán)次

4、數(shù)（Ct值）和反應(yīng)體系的底物濃度就會(huì)形成一個(gè)嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值，即可以準(zhǔn)確地確定擴(kuò)增基因的濃度….實(shí)時(shí)熒光PCR在全封閉狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增.熒光探針雜交，信號(hào)檢測(cè)不需電泳和EB染色,可以有效地降低污染和假陽(yáng)性的產(chǎn)牛，具有操作簡(jiǎn)單,省時(shí)省力，精確性高，特界性強(qiáng)，安全快速，準(zhǔn)確靈敏等優(yōu)點(diǎn).漆艷香等硝將玉米細(xì)菌性枯萎病菌16S1DNA基因克隆測(cè)序，根據(jù)該細(xì)菌與其它待測(cè)細(xì)菌菌株16srDNA序列差異,設(shè)計(jì)岀對(duì)玉米細(xì)菌枯萎病菌具有穩(wěn)定點(diǎn)突變的特異性探針?進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示只有玉米細(xì)菌性枯萎病菌產(chǎn)生熒光，且靈敏度較高，反應(yīng)體系中只要

5、有2個(gè)活細(xì)菌，實(shí)時(shí)熒光PCR就能檢測(cè)到.根據(jù)此技術(shù)原理與路線,漆艷香等又分別構(gòu)建了苜蓿萎驚病菌,菜豆細(xì)菌性萎驚病菌B。］和香蕉細(xì)菌性枯萎病菌…的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)體系.朱建裕等n根據(jù)梨火疫細(xì)菌中獨(dú)特含有質(zhì)粒pEA29,設(shè)計(jì)了1對(duì)引物和3條探針，建立了梨火疫細(xì)菌實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)方法.2REP—PCR原核與真核牛物中普遍存在著散布的重復(fù)DNA序列，這些序列由于發(fā)揮著生物體基本的功能作用，因此在進(jìn)化屮呈高度保守的狀^.REP(repetitiveeX?tragenicpalindromic)^nERIC(enterobactefialrepetitivei

6、n?tergenicC012Sensus))H于這樣的序列.研究發(fā)現(xiàn),REP,ERIC等序列在微生物中廣泛存在，隨機(jī)分布且在進(jìn)化中呈高度保守狀態(tài).因此，研究人員以REP,ERIC等序列為引物，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳得到不同帶型，從而形成了被測(cè)菌基因組特異的指紋圖譜，該技術(shù)稱rep-PCRDNA指紋技術(shù).該技術(shù)方法簡(jiǎn)單，快速，敏感和分辨率高,現(xiàn)普遍應(yīng)用于流行病學(xué)中的致病菌株鑒定和確定廣西熱帶農(nóng)業(yè)2006年第4期(總第105期)細(xì)菌間的親緣關(guān)系.S.V.Tsygankova等”對(duì)Xanthomonas,pseudumon

7、as,Erw/n/a等病原菌進(jìn)行鑒定時(shí),發(fā)現(xiàn)所有被測(cè)的.campestr/s均能通過(guò)引物KRPN2擴(kuò)增出一段約600bp的片段，接著用引物SCAR進(jìn)行擴(kuò)增，在所有的.?tr/s上出現(xiàn)一條特異性條帶，而在其他的被測(cè)菌株上不能出現(xiàn)他利用這特點(diǎn)，進(jìn)行rep-PCR,結(jié)果能有效，迅速地對(duì)被測(cè)菌株進(jìn)行鑒定.J.Louws等［14在對(duì)339個(gè)Xant~monas進(jìn)行鑒定時(shí),也成功地應(yīng)用了rep一PCR技術(shù)獲得理想結(jié)果.在日本,Ralstoniasolanacearum小種4和小種1廣泛存在于西紅柿，馬鈴薯等植物上,除非進(jìn)行致病性測(cè)試，否則很難將兩者區(qū)分,Mitsuo

8、Horita等人利用小種4中存在特異性序列(AKIF—AKIR)和(21F—21