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《T∕CVMA 12-2018 豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光R∕T-PCR檢測方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11.220B41團體MA標準T/CVMA12—2018豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR檢測方法Real-TimeRT-PCRfordetectionofporcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus中國獸醫(yī)協(xié)會CVMA2018-10-24發(fā)布2018-10-24實施中國獸醫(yī)協(xié)會發(fā)布T/CVMA12—2018前言本標準按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標準由中國獸醫(yī)協(xié)會提出并歸口。本標準起草單位：中國動物疫病預(yù)防控制中心。本標準主要起草人：周智、王傳彬、楊林、吳佳俊、宋
2、曉暉、翟新驗、倪建強、劉玉良、張碩、劉穎昳、趙柏林、顧小雪、曲萍。CVMA中國獸醫(yī)協(xié)會IT/CVMA12—2018豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR檢測方法1范圍本標準規(guī)定了豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）通用型實時熒光RT-PCR診斷技術(shù)、鑒別美洲型和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒實時熒光RT-PCR診斷技術(shù)。本標準主要用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適
3、用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB/T25172豬常溫精液生產(chǎn)與保育技術(shù)規(guī)范NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術(shù)規(guī)范執(zhí)行3試劑與耗材3.1RNA提取試劑RNA提取試劑詳見附錄A，或選取商品化的病毒RNA提取試劑盒。3.2其他試劑TaqDNA聚合酶（5U/μL），PrimeScriptTMRTMixⅡ反轉(zhuǎn)錄酶混合物，50×ROXReferenceDyeⅡ,2×OneStepRT-PCRBufferⅢ緩沖液，無水乙醇，無菌無核酸酶水，生理鹽水。CVMA3.3引物探針中國獸醫(yī)協(xié)會3.3.1豬繁殖與呼吸綜合征病毒
4、（PRRSV）通用型實時熒光RT-PCR引物和探針，見表1。表1豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）通用型實時熒光RT-PCR引物和探針序列名稱序列（5＇-3＇）美洲型上游引物（NAF）TGGARATTCATCACCTCCAGR美洲型下游引物（NAR）GTGCCGTTRACCGTAGTGGA歐洲型上游引物（EUF）ACTTCCAGATGCAGATTGTGT歐洲型下游引物（EUR）GCCGTTCACTGATGTTAGTCC探針FAM-TACATTCTGGCCCCTGCCCAYCA-BHQ注：將表中引物和探針用無菌無核酸酶水稀釋至10pmol/
5、μL后使用。3.3.2美洲型和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重實時熒光RT-PCR引物和探針,見表2。表2美洲型和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒雙重實時熒光RT-PCR引物和探針序列1T/CVMA12—2018名稱序列（5＇-3＇）美洲型和歐洲型上游引物（NAF-EUF）CGCCAGCCAGTCAATCARC美洲型和歐洲型下游引物（NAR-EUR）GRGGAAAATGKGGCTTCTCMG歐洲型探針FAM-TCCTCCCCTRGGTTGCTGGCGCT-BHQ美洲型探針HEX-YCCCGGTCCCTTGCCTCTGGA-BHQ注：將表中引物和
6、探針用無核酸酶的滅菌蒸餾水稀釋至10pmol/μL后使用。4儀器與設(shè)備分析天平、高速離心機、熒光PCR儀、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器。5操作步驟5.1樣品采集5.1.1組織樣品采集組織樣品采集按照NY/T541進行。取病死豬肺臟、淋巴結(jié)、扁桃體等組織；待檢活豬，采集血液3mL～5mL，也可采取扁桃體樣品。5.1.2公豬精液采集公豬精液采集按照GB/T25172的方法進行。5.2樣品的處理5.2.1組織樣品處理每份組織分別從三個不同的典型病變位置處稱取樣品約1g，剪碎混勻后取0.02g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水繼續(xù)研磨，
7、待勻漿后轉(zhuǎn)至滅菌離心管中，6000×g離心2min，吸取上清液到新的離心管備用。5.2.2血液樣品處理CVMA將采集的血液中國獸醫(yī)協(xié)會室溫或者37℃傾斜放置，待血清析出后吸取上清液到新的離心管備用。5.2.3精液樣品處理精液樣品無需處理，直接用于核酸提取。5.2.4陽性對照樣品處理5.0取美洲型和歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒陽性組織研磨上清液各100μL(病毒含量10TCID50/mL)，用于病毒RNA提取。5.2.5陰性對照樣品處理取豬繁殖與呼吸綜合征病毒陰性組織研磨上清液100μL，用于病毒RNA提取。5.3病毒RNA提取2T/CVMA
8、12—20185.3.1若選用附錄A中所列試劑提取病毒RNA，則參照以下步驟進行操作：a)取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照各100μL，分別加入裂解液600μL，充分顛倒混勻，
