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《T∕CVMA 5-2018 非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS11.220B41團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CVMA5—2018非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法Real-timePCRassayfordetectionofAfricanswinefevervirusCVMA中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)2018-10-24發(fā)布2018-10-24實(shí)施中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)發(fā)布T/CVMA5—2018前言本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所、北京海關(guān)。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：倪建強(qiáng)、王傳彬、王
2、琴、仇華吉、殷宏、楊林、辛盛鵬、劉艷華、劉洋、宋曉暉、趙啟祖、羅玉子、劉志杰、張乾義、喬彩霞、夏應(yīng)菊、楊吉飛、徐璐、顧小雪、亢文華、李碩、畢一鳴。CVMA中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)IT/CVMA5—2018非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了非洲豬瘟病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法的試劑、儀器和耗材、操作步驟、結(jié)果判定、實(shí)驗(yàn)室生物安全等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織和血粉中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括
3、所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范3試劑3.1DNA提取試劑DNA提取試劑的配制見附錄A，或選取商品化的病毒DNA提取試劑盒并參照說明書進(jìn)行DNA提取。3.22×PCR緩沖液2×PCR緩沖液的配制見附錄A。CVMA3.3引物探針中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)3.3.1采用針對非洲豬瘟病毒VP72基因（核苷酸序列見附錄B）的引物及探針：上游引物ASF-CADC-rPCRF：5'-1528-ATAGAGATACAGCTCTTCCAG-1548-3'下游引物ASF-CADC-rPCRR：5'-16
4、60-GTATGTAAGAGCTGCAGAAC-1679-3'熒光探針ASF-CADC-Probe：5'-1638-FAM-TATCGATAAGATTGAT-MGB-1653-3'3.3.2可以使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）在陸生動(dòng)物診斷技術(shù)和疫苗手冊（ManualofDiagnosticTestsandVaccinesforTerrestrialAnimals）第2.8.1章AfricanSwineFever中提供的引物和探針，并按照手冊中規(guī)定的檢測程序和判定標(biāo)準(zhǔn)操作：上游引物ASF-OIE-rPCRF：5'-1627-CTGCTCATGGTATCA
5、ATCTTATCGA-1651-3'1T/CVMA5—2018下游引物ASF-OIE-rPCRR：5'-1857-ACGGCNGATCTTGTGGTATC-1876-3'熒光探針ASF-OIE-Probe：5'-1761-FAM-CCACGGGAGGAATACCAACCCAGTG-TAMRA-1785-3'3.3.3使用國家農(nóng)業(yè)行政主管部門批準(zhǔn)的其他引物、探針，應(yīng)對檢測程序和判定標(biāo)準(zhǔn)作相應(yīng)調(diào)整。3.4陰性及陽性對照陰性及陽性對照的制備方法見附錄C。3.5其他試劑消毒液、5U/μLTaqDNA聚合酶、無菌無核酸酶水、0.01mol/LPBS（pH7.2）
6、。消毒液配制見附錄A，0.01mol/LPBS配制見附錄A。4儀器和耗材分析天平（感量0.1mg）、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（最高離心速度不低于12000r/min）、冰盒、實(shí)時(shí)熒光PCR儀及配套反應(yīng)管（板）、組織研磨器、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2μL，20μL，200μL，1000μL）、1.5mL離心管（無核酸酶）。5操作步驟5.1樣品采集及運(yùn)輸樣品采集及運(yùn)輸按照NY/T541的規(guī)定執(zhí)行，采集豬的脾臟、淋巴結(jié)、血液等組織材料或血粉用于檢測，樣品應(yīng)在冷藏條件下盡快運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，避免反復(fù)凍融。采樣時(shí)應(yīng)穿戴個(gè)人生物安全防護(hù)裝備，實(shí)施現(xiàn)場消毒和廢棄物處理。5.
7、2樣品處理中國獸醫(yī)協(xié)會(huì)CVMA檢測前樣品應(yīng)在二級生物安全柜中處理。取0.1g～0.2g組織或血粉，經(jīng)研磨破碎后加1mL的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成勻漿，經(jīng)10000r/min離心取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5mL離心管內(nèi)蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。5.3樣品保存采集或處理好的樣品在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過24h；如需長期保存，應(yīng)放置-70℃冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過3次）。5.4病毒DNA提取5.4.1DNA提取應(yīng)在樣本制備區(qū)內(nèi)采用以下方法進(jìn)行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑
8、，則按照試劑說明書操作。5.4.2待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數(shù)總和用n表示，取n個(gè)滅菌1
