磁性標記骨髓間充質干細胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究

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1、中山大學博士學位論文磁性標記骨髓間充質干細胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究姓名：劉宇申請學位級別：博士專業(yè)：病理學與病理生理學指導教師：鄧宇斌20090525中山大學博士學位論文磁性標記骨髓間充質干細胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究磁性標記骨髓間充質干細胞用于大鼠脊髓損傷中示蹤的研究博士研究生：劉宇導師：鄧宇斌教授專業(yè)：病理學與病理生理學摘要脊髓損傷(spinalcordinjury,SCI)是嚴重的中樞神經(jīng)損傷，致死、致殘率高，嚴重危害人民健康，給家庭和社會帶來巨大的經(jīng)濟和精神負擔。長期以來，脊髓損

2、傷的治療作為全球醫(yī)學界尚未解決的重大難題之一，仍然缺少實質性改善受損脊髓功能的治療手段。現(xiàn)有的臨床治療手段主要是早期應用大劑量激素及手術治療等，但是對于脊髓損傷的治療效果均不佳。近年來，移植外源性干細胞促進脊髓損傷修復成為目前的研究熱點。骨髓間充質干細胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是一種成體干細胞，具有自我更新及多向分化潛能，移植入體內(nèi)后能夠分化為神經(jīng)元樣細胞替代死亡的神經(jīng)細胞，建立神經(jīng)通路或分泌營養(yǎng)因子，挽救損傷神經(jīng)，促進軸突再生等發(fā)揮作用。且具有易于獲取、來源豐富、沒有明

3、顯移植排斥反應、易于轉染外源基因等優(yōu)點，在治療脊髓損傷方面有很好的應用前景。然而，干細胞移植入體內(nèi)后遷移和分布的機制仍不明確。為追蹤干細胞移植后體內(nèi)的遷移和分布，以往的試驗大多采用病理學手段，以GFP、Brdu等標記移植細胞后移植到損傷脊髓內(nèi)，在多時間點處死動物取組織切片，用免疫組化、免疫熒光的方法來檢測移植細胞。但是以上方法需要在不同時間點處死實驗動物以獲取觀察材料，所以無法在同一活體動物體內(nèi)連續(xù)多時間點的觀察移植細胞的遷移、分布及分化情況，在科研與臨床研究中存在許多限制。分子影像學(molecul

4、arimaging，MI)是分子生物學與現(xiàn)代醫(yī)學影像技術相結合的產(chǎn)物，是--f-j新興的邊緣學科。1999年美國哈佛大學Weissleder等人首先提出中山大學博士學位論文磁性標記骨髓間充質干細胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究分子影像學的概念，即應用影像學方法，對活體狀態(tài)下體內(nèi)分子的生物化學過程進行定性和定量研究。磁性標記作為分子影像學技術中較有優(yōu)勢的一種，是將磁性對比劑轉入干細胞后移植入體內(nèi)，借助磁共振成像(M砌)顯示標記的細胞，能夠在活體特異性的連續(xù)追蹤移植細胞，具有良好的組織分辨率、無創(chuàng)傷、無電

5、離輻射等優(yōu)點；并且可以很方便的應用相關軟件經(jīng)過三維重建來反映干細胞分布的全貌，十分適合追蹤干細胞在體內(nèi)的遷移和分布。目前MSCs移植修復脊髓損傷的途徑主要有：原位、蛛網(wǎng)膜下腔和靜脈三條，主要以原位注射為主。磁性標記干細胞體內(nèi)示蹤較多采用的是鐵標記(SPIO)，該標記方法在T2上的圖像會受到出血的影響，原位注射過程導致的出血是無法完全避免的，這影響了鐵標記在脊髓損傷原位移植細胞的示蹤中的應用。而釓(Gd)標記為T1正性信號，不會受到出血等干擾因素的影響，但目前釓標記與鐵標記相比，分辨率低下是其主要問題。

6、蛛網(wǎng)膜下腔注射與原位移植相比，損傷小，遷移到損傷部位的干細胞又遠遠高于靜脈移植，是有應用前景的移植方法，目前對于蛛網(wǎng)膜下腔注射的MSCs是如何遷移到脊髓損傷部位的了解仍很少。本課題組在前期研究中構建了大鼠脊髓損傷模型，建立了一整套分離培養(yǎng)BMSCs的方法，將MSCs移植到大鼠脊髓損傷原位，改善了損傷的神經(jīng)功能，以免疫組化、免疫熒光等方法觀察到了移植細胞的存活和分化。本研究在前期工作的基礎上，結合分子影像學的最新進展，針對脊髓損傷中不同移植方式的特點，分別采用Gd和Fe標記損傷原位和蛛網(wǎng)膜下腔移植的MS

7、Cs，以3TMⅪ和小動物線圈追蹤移植細胞在體內(nèi)的遷移和分布，并與GFP標記的病理結果、功能評分的改善等相驗證，全面客觀的評價移植細胞在脊髓損傷模型中的遷移和分布。本研究包括以下二個部分：第一部分：釓標記骨髓間充質干細胞在脊髓損傷原位移植后的示蹤研究方法：實驗分為體外、體內(nèi)兩部分。體外部分：以Jetpei、魚精蛋白轉染試劑標記MSCs，在Mm下檢測標記細胞的信號強度；以掃描電鏡確認標記的Gd顆粒在細胞內(nèi)的分布；以MTT、臺盼藍、多向誘導分化實驗檢測標記后對細胞增殖、分化等生物學活性的影響。體內(nèi)部分：制作

8、大鼠脊髓損傷模型，觀察其在MR下的圖像特點；移植未標記的MSCs，觀察MR下信號的改變；移植GFP、Gd—DTPA／Jetpei標記的MSCs，連續(xù)觀察移植后1、3、7、14天的M融圖像，并．1I．中山大學博士學位論文磁性標記骨髓間充質干細胞在大鼠脊髓損傷模型中示蹤的研究在相應時間點取材切片，以免疫熒光驗證Mm上的發(fā)現(xiàn)。以BBB評分評價Gd—DTPA標記的MSCs、未標記的MSCs對運動功能恢復的影響。結果：體外部分：Gd—DTPA／Jetpei能夠高效