GBT27521-2011-豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法.pdf

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1、ICS11．220B41a雷中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB／T27521—2011豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法RT-PCRassayforswineinfluenzavirusnucleicacid2011-11-21發(fā)布2012-03-01實(shí)施中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局學(xué)右中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)厘111標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載目q蟊GB／T27521--2011本標(biāo)準(zhǔn)按照GB／T1．12009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部提出。本標(biāo)準(zhǔn)由全國動(dòng)物

2、防疫標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(sAC／TC181)歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：喬傳玲、韓雪清、楊煥良、劉業(yè)兵、陳艷、吳紹強(qiáng)、陳化蘭、林祥梅、辛?xí)怨?、朱中武、王慧煜、劉建、李建、梅琳、王伊琴、徐彪、阮周曦、寧宜寶、薄清如、秦智鋒、林志雄。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載1范圍豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法GI／T27521—2011本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流感病毒核酸RT-PCR檢測方法的技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的R

3、T·PCR檢測方法適用于檢測豬肺臟組織、鼻腔及氣管分泌物和這些采集樣品培養(yǎng)物中的豬流感病毒核酸。2縮略語下列縮略語適用于本文件。DEPC：焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate)dNTP：脫氧核苷酸三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate)EB：溴化乙錠(ethidiumbromide)M_MLVRT：莫洛尼氏鼠白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶(moloneymurineleukemiavirusreversetran．-scriptase)PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

4、(polymerasechainreaction)RNA：核糖核酸(ribonucleicacid)RNAaseinhibitor：RNA酶抑制劑RT-PCR：反轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse_transcriptionpolymerasechainreaction)SPF：無特定病原體(specificpathogenfree)ngDNApolymerase：TnqDNA聚合酶3儀器3．1PcR儀。3．2臺(tái)式低溫高速離心機(jī)。3．3電泳儀。3．4電泳槽。3．5冰箱。3．6凝膠成像系統(tǒng)。3．

5、7微量移液器。3．8水浴鍋。4試劑4．1LSTRIzolRNA提取試劑或其他商品化的RNA提取試劑。4．2氯仿、異丙醇、無水乙醇。4．31．2％瓊脂糖凝膠，見附錄A中A．1。4．450×TAE緩沖液，見附錄A中A．2。標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載GB／T27521--20114．5溴化乙錠(EB，10pg／pL)或核酸染料，見附錄A中A．3。4．6焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的滅菌雙蒸水，見附錄A中A．4。4．7DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(100bp)。4．8M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。4．9RN

6、A酶抑制劑。4．10TaqDNA聚合酶。4．11dNTP。4．12商品化的一步法RT—PCR反應(yīng)試劑。含有RT-PCR緩沖液，酶混合物，dNTP混合物，無RNA酶的水等。5引物5．1反轉(zhuǎn)錄引物見附錄B中B．1。引物濃度為20pmol／pL。5．2PCR引物見附錄B中B．2。引物濃度均為20pmol／pL。6樣品對照以滅活的豬流感病毒感染SPF雞胚尿囊液或者感染動(dòng)物的組織作為陽性對照，以正常SPF雞胚尿囊液或者正常動(dòng)物組織作為陰性對照。7操作步驟7．1樣品的采集及處理7．1．1采樣工具下列采樣工具

7、應(yīng)經(jīng)121℃士2℃，15rain高壓滅菌并烘干；a)棉拭子；b)剪刀；c)鑷子；d)1．5mL離心管；e)研缽。7．1．2活豬取鼻拭子。采集方法如下：將棉拭子深入鼻腔旋轉(zhuǎn)，取鼻腔分泌液；將采樣后的拭子分別放入盛有1．0mLPBS(見附錄A中A．5)的1．5mL離心管中，加蓋、編號(hào)。7．1．3病死豬取肺臟或氣管分泌物等。采集方法如下：用無菌鑷子和剪刀采集肺臟等，裝入一次性塑料袋或其他滅菌容器，編號(hào)。7．1．4樣品貯運(yùn)樣品采集后，放人密閉的塑料袋內(nèi)(一個(gè)采樣點(diǎn)的樣品放一個(gè)塑料袋)，于保溫箱中加冰、密

8、封，24h內(nèi)送實(shí)驗(yàn)室。2標(biāo)準(zhǔn)分享網(wǎng)www.bzfxw.com免費(fèi)下載CB／T27521—20117．1．5樣品處理7．1．5．1棉拭子處理方法樣品在混合器上充分混合后，用高壓滅菌鑷子將拭子中的液體擠出，棄去拭子，室溫靜置30min，4℃、3000r／rain離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌的1．5mL離心管中，編號(hào)備用。7．1．5．2臟器處理方法將所采組織病料置于潔凈、滅菌并烘干的研磨器中，按質(zhì)量體積比(1：1)加入樣品保存液進(jìn)行充分研磨；4℃、3000r／min離心15min，取上清液轉(zhuǎn)入無菌