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《豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬流感病毒二重RT-PCR檢測方法的建立-論文.pdf》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、豬繁殖與呼吸綜合征病毒與豬流感病毒．．．．—●．．．．．—▲重RT-PCR檢測方法的建立王洪光’，湯德元。曾智勇’。羅險峰，李春燕’，郝飛’，劉建’。李達(dá)’(1．貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550025；2．貴州省動物疫病預(yù)防控制中心。貴州貴陽550008)摘要：為建立可同時檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)與豬流感病毒(SIV)二重RT-PCR方法，研究根據(jù)GenBank登錄的相關(guān)病毒基因序列，選擇保守區(qū)域設(shè)計引物。經(jīng)過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了可同時檢測以上2種病毒的RT-PCR診斷方法，擴(kuò)增的目的片段長度分別為364bp(PRRSV)和98
2、1bp(sly)。通過實(shí)驗(yàn)證明該方法具有良好的特異性和較高的敏感性，對PRRSV和SIV的核酸檢測最低濃度分別為3．2X10ng和2．7X10～ng。應(yīng)用該方法對32份臨床樣品進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，PRRSV陽性率為43．8％，SIV陽性率為31．3％，二重感染率為9．4％。該方法的成功建立為快速高效地檢測以上2種病毒提供了有力手段。關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；豬流感病毒；二重RT-PCR隨著現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)規(guī)模化和集約化的表1擴(kuò)增目的片段的引物發(fā)展，豬群發(fā)生多種病原混合感染和繼■■■■墨墨矗弱曩雹蜀商曩發(fā)感染的情況越來越普遍，豬病的復(fù)雜PRRSV0RF636
3、4程度及其危害也與日俱增。目前，豬呼TTAAAGATGAGCCTTCTGACCGAGGSIv¨AGCGCTATGTTGACAAAATGACC吸道疾病是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的主要疾病，也是我國規(guī)?；i場的常發(fā)病、多行擴(kuò)增，該方法不僅具有特異、快速、U1"31versalGenOm1cDNA&RNA發(fā)病，已經(jīng)引起人們的普遍重視，給敏感、成本低等優(yōu)點(diǎn)，更適用于大量臨ExtractionKitVer．4．0購自大連宅我國養(yǎng)豬業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。在豬床樣品的檢測151。本研究擬建立一種能生物工程有限公司；E．Z．N．A．TM場常發(fā)生的各類病毒性呼吸道疾病中，夠同時
4、并同步檢測上述2種病原體單一GelExtractionKit(50)膠回收試劑盒PRRSV和SIV等是最為多見的病原??；蚧旌细腥镜腞T-PCR方法，以對臨系OMEGA公司產(chǎn)品；普通質(zhì)粒小提PRRSV和SIV引起的豬呼吸道疾病主床病料進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；異丙要以發(fā)熱、咳嗽、氣喘、呼吸困難、眼1材料與方法醇、無水乙醇等為國產(chǎn)分析純試劑。鼻分泌物增多、食欲減退、迅速消瘦等1．1病毒、細(xì)胞、質(zhì)粒及菌株IcyclerThermalcycler型PCR儀為為特征；同時PRRSV還是引起妊娠母PRRSV系貴州省動物疫病研究室BI
5、O—RAD公司產(chǎn)品。豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、無活鑒定并傳代保存；SIV系華南農(nóng)業(yè)大學(xué)1．3引物設(shè)計力弱仔、畸形胎，少仔和不育的豬繁惠贈；mark-145系中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察參照NCBI中PRRSVORF6殖障礙性疾病的主要病因之一1231。自所惠贈；pMD19-TVector購自大連寶(NC一00l961)、SIVM(GU086140)Mullis1983年建立PCR技術(shù)以來，該生物公司；大腸桿菌感受態(tài)ToplO由等基因序列，應(yīng)用DNAStar、Oligo、方法不斷得到發(fā)展，目前已成為當(dāng)今動貴州省動物疫病研究室制備和保存。MPprimerandM
6、FEprimer設(shè)計多重物疫病檢測和診斷中最具應(yīng)用價值的方1．2主要試劑及儀器PCR引物，用于擴(kuò)增目的基因片段【6】。法，該方法廣泛應(yīng)用于分子應(yīng)用生物學(xué)MEM培養(yǎng)基、新生牛血清(NCS)引物序列詳見表1。及其相關(guān)領(lǐng)域。mPCR是指在同一均系Hy-Clone公司產(chǎn)品；分子質(zhì)量1．4病毒核酸提取PCR反應(yīng)體系中使用多套引物，針對標(biāo)準(zhǔn)物DL2000Marker購自大連寶生分別將接毒細(xì)胞懸液及臨床勻漿樣多個核酸模板或同一模板的多個區(qū)域進(jìn)物工程有限公司；TaKaRaMiniBEST品反復(fù)凍融3次后，各取200p-L，參照RNA&DNA提取試劑盒說明書，基金項(xiàng)目
7、：貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目資助(黔科合J字【201312110號)；貴州省2011年農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目資助【鳊號：黔科合NY字(2011)5l05號】；貴州省2010年農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目【編號：黔科合NY字(2010)3042號1．按步驟提取病毒RNA，利用蛋白質(zhì)核研農(nóng)20l4015酸儀測定其濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。作者簡介：王洪?1989-)，女，碩士研究生，主要從事動物傳染病病原分子病毒學(xué)的科研學(xué)習(xí)。·通訊作者：湯德元(1964-)，男，教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事動物傳染病病原分子生物學(xué)和1．5RT-PCR反應(yīng)中西獸醫(yī)結(jié)合的教學(xué)科研工作。E—ITl
8、aiI：tdyua．n@l65．corn單一RNA病毒RT-PCR反應(yīng)。98豬業(yè)科學(xué)SWINEINDUSTR
